《自然》子刊：CRISPR再曝重大漏洞！遗传学大牛发现CRISPR/Cas9会在作用靶点远处导致大规模DNA删除

最受关注的基因编辑技术是什么？CRISPR！其中走得最快的系统是哪个？CRISPR/Cas9！

近几年来，科学家不断对CRISPR/Cas9系统进行改造，更敏感的检测方法、更高效的Cas9酶、更好的递送方式……与临床之间的天堑鸿沟——脱靶效应，在研究者的努力下已经变得不那么可怕，使用CRISPR/Cas9进行的第一批临床试验也提上了日程。

稍等，CRISPR/Cas9真的如我们所想的那样安全吗？继上个月的致癌疑云之后，本周《自然生物技术》又曝新问题，由CRISPR/Cas9介导的DNA双链断裂修复，极有可能造成切割位点远端DNA大片段丢失、乃至其他更为复杂的基因突变[1]！

这种负面影响，一是丢失片段很长，可高达数千bp，可能影响细胞功能；一是距离切割位点较远，可以位于20kb之外，正常评估流程难以检测；一是随机性强，每个样本编辑后的基因型都有所不同，潜在影响的多样化巨大！

该项研究来自英国惠康桑格研究所，人类基因组计划中贡献最大的科研机构。文章通讯作者则是著名遗传学家AllanBradley教授，他致力于癌症与基因的研究，他担任研究所长期间重新调整了惠康桑格研究所的发展方向，研究所名下的十数个生物信息学数据库少不了他的功劳。[2]

一般来说，科学家认为Cas9导致的DNA修复不会造成20bp以上基因的插入和缺失[3-5]，不过实际上确实有研究曾发现，单gRNA诱导能够在小鼠受精卵中造成600bp以上的基因缺失[6]，同时，双gRNA诱导也表现出了比预期更加复杂的基因型改变[7]。

而且，在大多数研究中，对基因编辑结果的分析，往往只关注靶点和潜在脱靶位点周围很小一段区域（<1kb），这样很可能会错过一些并不连续的突变位点。再者，研究所使用的细胞往往来自癌细胞系，其基因组和DNA修复机制本来就不正常，结果是否能够推广到正常组织和细胞上也是个未知数。

Bradley教授和同事们认为，可能有大量的编辑错误我们并没有发现，如果这些异常基因位于正在活跃增殖的细胞中，那么很有可能会导致其他疾病。

为了搞清楚这个问题，研究者尝试用CRISPR/Cas9系统编辑雄性小鼠胚胎干细胞中的PigA基因。这个基因位于X染色体上，所以在XY细胞中没有等位基因。

研究者首先尝试了靶向基因外显子的单gRNA，编辑效率还是很高的，59-97%的细胞PigA基因都丧失了功能。

然而奇怪的是，靶向内含子的单gRNA也能够导致PigA基因失活。要知道这些靶点距离外显子还挺远，263-520bp之间的10个不同靶点编辑效率有8-20%，还有两个靶点距离外显子2kb开外，居然也能导致5-7%的PigA失活！

为了搞清楚这过程中发生了什么，研究者对PigA缺陷细胞进行了大规模测序，结果发现靶向内含子的编辑，居然也会造成外显子的缺失！也就是说CRISPR会造成意料之外的远端DNA缺失！

研究者又继续分离这些细胞挨个分析，发现将近四分之三的细胞（69/93）在切割位点和外显子部分存在基因缺失，大小各不相同，最大能达到9.5kb；剩下的细胞则同时还有大片段插入等复杂的问题。

值得注意的是，这些“病变”与目标靶点并不相邻，如果用通常的检测方法，是根本无法发现的。

研究者还尝试了从两端同时扩增来自部分缺陷细胞的PigA基因，结果只能得到两端的序列，得不到中间部分。进一步分析也显示，存在着基因易位、倒错这样更为严重的结构变异。

此外，细胞与细胞之间的基因缺失状况又各有不同，这意味着潜在的致病模式多得无法想象。

鉴于实验中PigA是单等位基因，考虑到可能具有特殊性，研究者又选取了另一种基因Cd9，这种基因位于常染色体上，并不是胚胎干细胞生存必须的基因，它的表达产物也很容易被染色检测。

重复以上实验，结果显示靶向外显子的gRNA编辑效率达到88%，而靶向内含子的编辑效率则在2.6-3.8%之间。考虑到破坏两个等位基因才能够阻止Cd9表达，这个结果实际上和PigA得到的基本一致。

测序结果也显示，Cd9基因中存在大片段缺失，最长达到5.5kb，而且27个Cd9缺陷细胞中，只有一个具有完整的外显子。

那么是不是由于小鼠胚胎干细胞尚未分化，具有某些特性，所以才造成这些问题的呢？同样的实验又在永生化人女性视网膜色素上皮细胞系（RPE1）和小鼠造血祖细胞中进行，结果也很相似。

转染方式也并非关键，无论是PB转座子系统，还是电穿孔和脂质体转染，CRISPR/Cas9造成的这种大片段缺失都是存在的。

本项研究中使用了小鼠的胚胎干细胞、造血祖细胞和人成熟分化细胞，前两者具有正常的DNA修复机制，而这三者都在临床研究中有着应用。

考虑到临床，事情就更加严肃了。临床中往往要一次性编辑数十亿个细胞，产生的大量不同突变很可能是致病的病变，乃至救命的细胞变成的致命的肿瘤。

Bradley教授表示，使用CRISPR/Cas9系统的风险“被严重低估了”，而本项研究“应当成为一记警钟。”

这篇论文刚刚发表二十分钟，业界领头的CRISPR先驱们股价大跌，CRISPRTherapeutics股价下跌8.6%，EditasMedicine下跌7%，IntelliaTherapeutics下跌近10%。超过3亿美元市值凭空蒸发。[8]

不过这些新贵们倒并不慌张，毕竟如果基因编辑真的会造成如此严重的后果，那么在锌指或TALENs技术中也应当有体现——很显然，并没有人观察到。

Intellia表示，他们一直在对小鼠编辑后基因组进行分析，目前为止还没有发现任何“致癌”的突变。其副总裁TomBarnes表示，这可能是由于Bradley团队采用了积极增殖的细胞，而Intellia使用的细胞更为“静止”[9]。

Editas则发布声明表示，公司致力于基于CRISPR的药物，并不会受到这项研究的影响。

现在的问题和我们上个月讨论的很类似了，如果这个现象是真的，那么我们为什么在此前的临床前实验中从未观察到小鼠大规模爆发肿瘤呢？

至少目前可以确定，体外编辑细胞之后，做个全基因组测序恐怕很有必要。