一文看透“校正因子”的影响因素

　　校正因子如何测定？耐用性如何考察？影响因素有哪些？本文借助印度NatcoPharma制药公司的一篇文章，抽提了其中的一些关键点和代表性图谱去回答这些问题，为药物分析人员提供了解决思路，能够降低研发风险。

　　这篇文章通过改变HPLC色谱条件的参数来研究相对响应因子（RelativeResponseFactor，RRF）/校正因子（CorrectionFactor，CF）的影响因素，考察因素包括：不同色谱柱、流速、pH值、柱温、缓冲液浓度、检测波长、不同检测器（UV和PDA）、不同溶剂级别等。结果表明某些色谱参数的改变可引起结果巨大变化，提示在HPLC方法开发和方法验证中应注意考虑的问题。

　　1.前言

　　相对响应因子（RRF）是一个与药物中杂质相关的重要参数，用来校正杂质对主成分峰的响应差异。RRF通常通过标准曲线法测定。

　　不同药典对于RRF的要求不同。USP的RRF是指等量的杂质和药物的响应值的比值，将RRF称为相对响应因子（RelativeResponseFactor，RRF）。EP/BP通常称为校正因子（CorrectionFactor，CF）。EP/BP的校正因子是USP相对响应因子的倒数。

　　当对照品不稳定性、想降低杂质制备成本、杂质的合成或分离难度很大、以及为了节约检测时间或提高效率时，往往需要测定并建立杂质RRF值。RRF值可用于不同阶段：如1-4期临床阶段，药物纯度测试、质量平衡测试、杂质测试、稳定性指示方法研究等。

　　2.相对响应因子的测定

　　标准曲线法

　　在测定RRF值之前，先测定空白溶剂、分离度溶液、对照溶液，系统适用性应符合要求。

　　方法1

　　配制至少7份单个主成分和单个杂质溶液，浓度为供试品浓度的0.1％-1.0％（例如0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％和1.0％），或配制至少3个点低于限度（高于LOQ）3个点高于限度7份单个主成分和单个杂质溶液。

　　在同一色谱条件下测定。

　　方法2

　　配制至少7份单个主成分和所有杂质混合溶液（如果杂质间不相互干扰，可进杂质混合溶液），浓度为供试品浓度的0.1％-1.0％（例如0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％和1.0％），或配制至少3个点低于限度（高于LOQ）3个点高于限度共7份单个主成分和所有杂质混合溶液。

　　在同一色谱条件下测定。

　　方法3

　　配制至少7份主成分和所有杂质的混合溶液（如果所有峰不相互干扰，可进主成分、杂质的全混合溶液），浓度为供试品浓度的0.1％-1.0％（例如0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％和1.0％），或配制至少3个点低于限度（高于LOQ）3个点高于限度共7份主成分和所有杂质的混合溶液。

　　在同一色谱条件下测定。

　　绘制主成分浓度对峰面积的标准曲线图，不包含“零”点。

　　绘制杂质浓度对峰面积的标准曲线图。

　　所有数据点使用最小二乘法列出线性回归方程

　　即y=mx+c

　　确定每个线性回归方程的斜率。

　　主成分和杂质的相关系数均应不小于0.995。

　　有用的计算公式

　　公式1：

　　主成分或杂质的浓度=重量（mg）/稀释（mL）×（游离碱的分子量/盐的分子量）×纯度

　　公式2：

　　主成分或杂质的浓度=重量（mg）/稀释（mL）×纯度

　　公式3：

　　杂质的相对响应因子=杂质的斜率/主成分的斜率

　　（注意：计算时，如果杂质的斜率为分子，则计算出的相对响应因子值在用于计算药物中的杂质含量时，应出现在分母中，即除以该值）。

　　公式4：

　　杂质的校正因子=主成分的斜率/杂质的斜率

　　（注意：计算时，如果杂质的斜率为分母，则计算出的校正因子值在用于计算药物中的杂质含量时，应出现在分子中，即乘以该值）。

　　注意事项

　　1根据杂质或主成分对照品使用说明书规定确定含量及杂质或主成分存在形式，必要时进行折算。

　　2当采用其他实验室（除药典对照品外）的对照品时，宜测定LC-MS、色谱纯度、TGA等。

　　3如果杂质为定量测定，应在原料或制剂的杂质限度附近（低于、相当、高于）测定RRF。

　　4RRF值应经过二次确认。

　　影响RRF值的因素（文献报道）

　　[1]色谱柱的变化（同种型号来自不同色谱柱制造商）

　　[2]色谱柱粒径的变化

　　[3]检测波长的变化

　　[4]检测器的变化

　　[5]溶剂级别的变化

　　[6]缓冲液浓度的变化

　　[7]柱温的变化

　　[8]流速的变化

　　[9]pH值的变化

　　基本信息

　　甲磺酸伊马替尼是一种抗肿瘤药物，分子式为C29H31N7O·CH3SO3H，分子量为589.7。

　　甲磺酸伊马替尼片中含有两种已知杂质，即杂质F（去甲基杂质）和杂质G（异构体）。甲磺酸伊马替尼、杂质G、F的结构式和光谱图见图1-3。

　　试验准备

　　1仪器

　　Waters高效液相色谱仪（泵为2487，检测器为2695，工作站为Empower2）

　　色谱柱：WatersX-BridgeC18，250x4.6mm,5μm

　　微量天平：MettlerToledo，XP6

　　分析天平：MettlerToledo，AB204S

　　pH计：LabIndia，Pico+

　　2试剂

　　水、三乙胺、磷酸二氢钠均为HPLC级；乙腈、甲醇均为梯度级；甲磺酸伊马替尼、杂质G、杂质F工作对照品由NatcoPharmaLimited，Hyderabad，India公司提供。

　　3溶液配制

　　缓冲液：取3.0g磷酸二氢钠二水合物，用1000mL水溶解，用三乙胺调节pH值至8.0±0.05

　　混合溶剂：甲醇-乙腈（600:400）

　　流动相A：缓冲液-混合溶剂（550：450）

　　流动相B：混合溶剂

　　溶剂：流动相A

　　杂质G和杂质F储备液：精密称取杂质G和杂质F对照品各5.0mg，置25mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

　　对照品溶液：精密称取甲磺酸伊马替尼24.0mg，置100mL量瓶，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。取上述溶液1.0mL，置100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。

　　样品溶液：精密称取甲磺酸伊马替尼片细粉适量（相当于伊马替尼100mg），置100mL量瓶中，加溶剂60mL，超声处理15分钟，不时振摇，放冷至室温，用溶剂稀释至刻度，混匀，在3500rpm下离心处理10分钟，取上清液。

　　4色谱条件及色谱图

　　色谱柱：X-BridgeC18，250mm×4.6mm，5μm

　　柱温：30℃

　　流速：1.0mL/min

　　进样量：20μL

　　检测波长：230nm

　　运行时间：60min

　　伊马替尼及其杂质在此色谱条件下在230nm附近均有较大吸收，混合溶液的色谱图见图10，RRT值和RRF值见表2。

　　相对响应因子的测定（分析人员-1）

　　1溶液配制

　　储备溶液制备（主成分和杂质混合物）：精密称取5.002mg甲磺酸伊马替尼、4.978mg杂质F和5.029mg杂质G，置100mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

　　对照品和杂质的纯度和称样量见表3。

　　从储备液制备成各浓度溶液（0.02％-1.00％）的过程及线性范围试验结果见表4-6。

　　杂质F和G相对响应因子的计算（分析人员-1）

　　[1]甲磺酸伊马替尼储备液的制备：

　　储备液制备=（5.002/100）（99.0/100）（493.6/589.7）1000=41.45ppm

　　稀释溶液=储备溶液（ppm）×取样体积（mL）/稀释至体积（mL）

　　注：折算系数为493.6/589.7，493.6为伊马替尼的分子量，589.7为甲磺酸伊马替尼的分子量。

　　[2]杂质F储备液的制备：

　　储备液制备=（4.978/100）×（94.8/100）×1000=47.19ppm

　　稀释溶液=储备溶液（ppm）×取样体积（mL）/稀释至体积（mL）

　　[3]杂质G储备液的制备：

　　储备液制备=（5.029/100）×（92.3/100）×1000=46.42ppm

　　稀释溶液=储备溶液（ppm）×取样体积（mL）/稀释至体积（mL）

　　[4]杂质RRF的计算：

　　公式=已知杂质的斜率/主成分的斜率

　　杂质F的RRF=杂质F的斜率/伊马替尼的斜率=61754.05/74167.65=0.83

　　杂质G的RRF=杂质G的斜率/伊马替尼的斜率=68661.27/74167.65=0.93