ZNF281对结直肠癌细胞侵袭与迁移的影响

　　ZNF281对结直肠癌细胞侵袭与迁移的影响

　　方法选取本院2014年6月至2016年6月收治的50例结直肠癌患者的癌灶标本及20例癌旁正常黏膜标本，比较不同标本中ZNF281的表达情况，利用Transwell小室观察ZNF281对结直肠癌细胞侵袭与迁移能力的影响，并分析ZNF281与临床病理指标的关系。

　　结果ZNF281在结直肠癌标本中的阳性表达率为84.00%，在癌旁正常黏膜中阳性表达率为20.00%，且几乎无强阳性表达，差异具有显著性（P＜0.05）。Transwell小室侵袭检测结果提示，ZNF281高表达组穿膜细胞数明显高于ZNF281低表达组和ZNF281阴性表达组（P＜0.05）；Transwell小室迁移检测结果提示，ZNF281高表达组穿膜细胞数明显高于ZNF281低表达组和ZNF281阴性表达组（P＜0.05）。ZNF281表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤部位无相关性（P＞0.05），但其在结直肠癌不同分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况及Duke's分期方面均具有显著差异（P＜0.05）。

　　结论ZNF281在结直肠癌组织中表达水平升高，且不同病理分化程度组织中ZNF281表达有显著差异。ZNF281可能参与结直肠癌的发生，同时可影响癌细胞的迁移能力，检测ZNF281表达对结直肠癌的诊断、治疗及预后具有一定临床意义。

　　关键词：锌指蛋白281；结直肠癌；侵袭；迁移

　　结直肠癌是临床常见恶性肿瘤之一，具有高发病率、高死亡率及低治愈率的特点[1]。近年来虽然结直肠癌的诊断和治疗较既往有了很大进步，但患者总体生存率并未得到明显改善，5年生存率约为55%，尤其对于晚期结直肠癌，多伴有远处转移，患者预后极差[2]。目前临床多采用外科治疗结直肠癌，通过根治性切除癌灶，以缓解该病进展。研究显示，仅70%的结直肠癌患者可行直肠癌根治术治疗，且此类患者的预后与肿瘤病理学分期具有相关性，通常将是否伴有淋巴结转移作为预测患者预后的因素[3，4]。基因靶向治疗可通过特定基因靶点抑制肿瘤细胞表达，进而发挥抑制肿瘤进展的作用，是目前治疗肿瘤的新策略[5]。锌指蛋白（zincfingerprotein，ZNF）是指与Zn2+结合的一类蛋白质，其可选择性结合于特异的靶结构，在基因表达调控、细胞分化及胚胎发育等过程中具有重要作用[6]。

　　ZNF281是ZNF的亚型，该蛋白在肿瘤恶性增殖或病变细胞中呈现高表达[7]。本研究分析了ZNF281对结直肠癌细胞侵袭与迁移的影响，旨在探讨ZNF281表达与结直肠癌发生、发展的关系，具体报道如下。

　　1、资料与方法

　　1.1、资料

　　50例结直肠癌标本和20例癌旁正常黏膜标本均取自2014年6月至2016年6月于本院行手术治疗的结直肠癌患者，其中，男29例，女21例；年龄27～80岁，平均（56.4±12.5）岁。入组标本均行病理切片检查确诊为结直肠癌，患者术前均未接受放、化疗或其他肿瘤综合治疗。标本组成：直肠癌21例，结肠癌29例，癌旁正常黏膜20例。本研究经本院伦理委员会审核批准，患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

　　1.2、方法

　　1.2.1、标本采集及处理

　　经手术获取癌灶组织和癌旁正常黏膜组织，生理盐水冲洗3次，置于10%中性甲醛溶液中固定48小时，常规脱水后石蜡包埋，制成4.0μm厚度的切片，而后对切片行HE染色，进行病理学诊断分析。

　　1.2.2、ZNF281表达检测

　　①取1片石蜡包埋后的切片进行ZNF281免疫组织化学染色，切片于60℃孵箱中加热1小时，脱蜡、水化，除去内源性过氧化物酶，将组织非特异性抗原封闭。抗体标记：一抗选用兔抗人ZNF281单克隆抗体（上海瑞齐生物科技有限公司生产，浓度为99%，具体使用方法参照说明书），4℃孵育1小时；二抗选用经生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白G（北京意宏安生物科技有限公司生产，浓度为0.5mg/ml，具体使用方法参照说明书），37℃孵育30分钟。②2名病理科主治医师采用双盲法独立阅片，ZNF281表达的评定主要依据组织染色强度和显色比例。评分标准：1分：显色阳性细胞数占总细胞数的百分比＜11%；2分：显色阳性细胞数占总细胞数的百分比为11%～50%；3分：显色阳性细胞数占总细胞数的百分比为51%～80%；4分：显色阳性细胞数占总细胞数的百分比＞80%。依据染色强度进行评分：1分：弱染色；2分：中等染色；3分：强染色。依据显色和染色强度将结果分为3级：无论染色强度如何，其显色比例评分≤1分为阴性（－），评分为2～3分为弱阳性（＋），评分为4～7分为强阳性［（＋＋）～（＋＋＋）］。

　　1.2.3、Transwell侵袭与迁移实验

　　结直肠癌细胞（HCT116）由中国科学院上海细胞库提供，置于含有10%胎牛血清培养液（江苏恩莫阿赛生物技术有限公司）中，于37℃、5%CO2温箱内培养，用0.25%浓度的胰蛋白酶消化常规传代（细胞培养4代后）。将结直肠癌细胞传代接种于无菌6孔板中，浓度为100个/100μl，待细胞贴壁后，用无血清培养液（江阴剑桥生物技术有限公司）培养，同时各取250μl无血清的培养液分别稀释ZNF281过表达的质粒（分为阴性表达、低表达及高表达，由南京德享文生物技术公司提供），静置10分钟后轻柔混匀，再次静置10分钟后加入细胞上清液中，6小时后换为完全培养液（江阴剑桥生物技术有限公司提供）继续培养48小时进行后续实验。①侵袭实验：将上述细胞重悬于无血清培养液中，以5×104个/孔的密度加入预先铺好Matrigel胶的Transwell小室上室内，向下室加入500ml完全培养液，于37℃、5%CO2的温箱培养24小时后用多聚甲醛（金锦乐化学有限公司，浓度为96%）固定，0.01%结晶紫（索莱宝公司）染色，于200倍光学显微镜（上海比目仪器有限公司，全相显微镜10XB）下计数穿膜细胞数，取5个视野，计算平均值，每组实验设3个复孔，重复3次。②迁移实验：将上述细胞重悬于无血清培养液中，以5×104个/孔的密度加入Transwell小室上室内，向下室加入500ml完全培养液，于37℃、5%CO2的温箱中培养24小时后用多聚甲醛（浓度为4%）固定，0.01%结晶紫染色，于200倍光学显微镜下计数穿膜细胞数，取5个视野，计算平均值，每组实验设3个复孔，重复3次。

　　1.3、统计学方法

　　采用SPSS15.2软件进行数据统计分析。计量资料以x±s表示，比较采用t检验；计数资料以%表示，比较采用χ2检验。P＜0.05为差异具有显著性。

　　2、结果

　　2.1、ZNF281在结直肠癌和癌旁正常黏膜标本中的表达情况比较

　　ZNF281在结直肠癌标本中阳性表达率为84.00%，在癌旁正常黏膜中阳性表达率为20.00%，且几乎无强阳性表达，比较差异具有显著性（P＜0.05）（表1）。阴性表达组穿膜细胞数为（132±10）个/视野，ZNF281高表达组穿膜细胞数明显多于ZNF281低表达组和ZNF281阴性表达组（P＜0.05）。

　　2.2、ZNF281对结直肠癌细胞侵袭能力的影响

　　Transwell小室检测结果提示，ZNF281高表达组穿膜细胞数为（215±13）个/视野，ZNF281低表达组穿膜细胞数为（165±10）个/视野，ZNF281阴性表达组穿膜细胞数为（57±8）个/视野，ZNF281高表达组穿膜细胞数明显多于ZNF281低表达组和ZNF281阴性表达组（P＜0.05）。

　　2.3、ZNF281对结直肠癌细胞迁移能力的影响

　　Transwell小室检测结果提示，ZNF281高表达组穿膜细胞数为（418±23）个/视野，ZNF281低表达组穿膜细胞数为（327±18）个/视野，ZNF281阴性表达组穿膜细胞数为（132±10）个/视野，ZNF281高表达组穿膜细胞数明显多于ZNF281低表达组和ZNF281阴性表达组（P＜0.05）。

　　2.4、ZNF281表达与结直肠癌各临床病理学指标的相关性分析

　　ZNF281表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤部位无相关性（P＞0.05），但ZNF281表达水平在结直肠癌不同分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况及Duke's分期方面均具有显著差异（P＜0.05）（表2）。

　　3、讨论

　　研究证实，肿瘤的发生、发展与多种因素有关，且为多步骤、多基因突变等共同引发的疾病[8]。结直肠癌作为临床常见的消化系统恶性肿瘤，其发生和发展过程也具有明显的阶段性，通常由正常的上皮经不典型增生形成腺癌、原位癌，最后出现浸润，发生远处转移[9，10]。随着分子生物学的发展，目前对于结直肠癌的研究已达到分子水平，有学者发现结直肠癌是由多个基因变异引起的。目前被普遍认可的结直肠癌分子途径主要包括4条：①抗原提呈细胞—β-catenin—Tcf—Myc途径；②HNPCC通路；③溃疡性结肠炎发生—细胞不典型增生—癌变通路；④基因的过度甲基化引起雌激素失活[11-13]。

　　ZNF281为ZNF家族中的一个亚型，是真核生物中存在的细胞因子，可诱导乳腺癌细胞上皮间质转换等侵袭行为。最新研究发现，ZNF281在结直肠癌细胞中也有表达，并发现其可通过干预目的基因的转录，调控特定基因表达的时间特异性和组织特异性，对细胞的生长、分化、凋亡及其他过程产生重要影响[14，15]。ZNF281具有诱发或抑制肿瘤的作用，研究发现ZNF281的表达通常伴有细胞的增殖，其在体外培养的成纤维细胞和肠上皮细胞中是一种可发挥促增生作用的调控因子[16，17]。但ZNF281也有一定的抑制细胞增殖的作用，研究发现ZNF281在前列腺癌和乳腺癌中可下调或者缺失[18]。本研究结果显示，ZNF281在结直肠癌标本中阳性表达率为84.00%，在癌旁正常黏膜中阳性表达率为20.00%，且几乎无强阳性表达，差异具有显著性。ZNF281表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤部位均无相关性，但ZNF281表达水平在不同分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况及Duke's分期方面均具有显著差异。结果提示，ZNF281在结直肠癌病变的发生、发展阶段存在高表达，在一定程度上可说明ZNF281可能是影响结直肠癌发生、发展的因素之一。

　　近年来，随着人们生活习惯和饮食结构的改变，结直肠癌的发病率不断升高，该病晚期多伴有远处转移。由于缺乏特异性较高的治疗药物是目前临床治疗的难点[19，20]，本研究通过体外侵袭与迁移实验，了解ZNF281对结直肠癌细胞侵袭与迁移能力的影响，结果显示，在结直肠癌细胞侵袭与迁移能力方面，ZNF281高表达组穿膜细胞数均明显多于ZNF281低表达组和ZNF281阴性表达组，说明ZNF281高表达可提高结直肠癌细胞的侵袭与迁移能力。因此，临床通过抑制ZNF281的表达可能抑制结直肠癌细胞的侵袭与迁移能力。

　　综上所述，ZNF281在结直肠癌组织中表达水平升高，且在不同病理分化程度中表达存在差异。ZNF281可能参与结直肠癌的发生，同时可影响癌细胞的迁移能力，可能成为治疗结直肠癌的新靶点。因此，检测ZNF281表达对结直肠癌的诊断、治疗及预后具有一定的临床意义。