PAX1基因甲基化定量检测在宫颈癌癌前病变诊断中的应用价值

　　探讨PAX1基因甲基化定量检测在宫颈癌癌前病变诊断中的应用价值。

　　方法选取2013年1月至2015年10月就诊于上海交通大学附属第六人民医院的121例高危亚型人乳头状瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）感染患者为研究对象。根据病理学结果将其分为正常宫颈组（28例）、低级别病变组[宫颈上皮内瘤变（cervicalintraepi-thelialneoplasia，CIN）Ⅰ，32例]、高级别病变组（CINⅡ～Ⅲ，34例）及癌变组[浸润性宫颈癌（invasivecervicalcancers，ICC），27例]。收集各组患者的宫颈组织标本及宫颈刮片，采用反转录聚合酶链反应和焦磷酸测序技术定量分析PAX1基因9个位点的甲基化水平，并通过接受者操作特征曲线（ROC曲线）计算PAX1甲基化与各级别宫颈病变的关联性。

　　结果癌变组、高级别病变组、低级别病变组、正常宫颈组PAX1基因9个位点的甲基化平均水平分别为4.66%、3.55%、2.10%、1.90%，组间比较差异均具有显著性（P＜0.05）。各组患者宫颈刮片和宫颈组织PAX1甲基化水平比较差异均具有显著性（P＜0.01），其中，癌变组PAX1甲基化发生率及水平均显著高于其他三组（P＜0.05）。通过PAX1基因甲基化水平鉴别诊断宫颈癌和CIN，结果显示其ROC曲线下面积为0.88（P＜0.001），具有较高的诊断能力。

　　关键词：宫颈癌癌前病变；焦磷酸测序；PAX1；甲基化

　　研究资料表明，宫颈癌的发病率和死亡率正逐年上升，已分别居女性恶性肿瘤发病率和死亡率的第3位和第4位[1]。研究显示，我国宫颈癌每年的新发病例数由2010年的2.85万～13.75万上升为2015年的4.58万～18.85万[2]。人乳头状瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）的持续性与反复性感染是宫颈癌最常见的病因之一[3]。研究表明，PAX1基因的异常甲基化表达升高，可在多个不同阶段及层次上影响宫颈癌及癌前病变的病理进程，与宫颈癌的发生及进展密切相关[4，5]。本研究基于反转录聚合酶链反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR）技术及焦磷酸测序技术，定量分析正常宫颈、低级别病变宫颈、高级别病变宫颈以及患癌宫颈的细胞及组织刮片中PAX1基因的甲基化水平，定量检测目的基因的甲基化水平，以明确其在区分各级宫颈病变中的临床应用价

　　值，现报道如下。

　　1、资料与方法

　　1.1、一般资料

　　选取2013年1月至2015年10月就诊于上海交通大学附属第六人民医院的121例高危型HPV感染患者为研究对象。排除妇科良/恶性肿瘤病史、妊娠、免疫及造血系统疾病相关病史患者。所有研究对象均签署知情同意书。121例患者依据病理分级不同分为正常宫颈组（28例）、低级别病变组[宫颈上皮内瘤变（cervicalintraepi-thelialneoplasia，CIN）Ⅰ，32例]、高级别病变组（CINⅡ～Ⅲ，34例）及癌变组[浸润性宫颈癌（invasivecervicalcancers，ICC），27例]。正常宫颈组患者平均年龄为（35.26±7.14）岁，HPVDNA定量为（367.35±105.72）mg/ml；低级别病变组患者平均年龄为（38.45±7.45）岁，HPVDNA定量为（492.74±142.91）mg/ml；高级别病变组患者平均年龄为（38.78±7.26）岁，HPVDNA定量为（613.65±186.21）mg/ml；癌变组患者平均年龄为（37.28±2.15）岁，HPVDNA定量为（376.74±114.24）mg/ml。四组患者一般资料比较差异均无显著性，具有可比性（P＞0.05）。

　　1.2、方法

　　1.2.1、宫颈标本采集与保存

　　患者取截石位，常规消毒铺巾，取少量宫颈病变部位的细胞制成宫颈刮片，阴道镜下钳取少量宫颈组织进行病理活检，并行HPV检查，4℃保存待用。研究时行宫颈组织活检，并收集宫颈刮片进行PAX1基因的甲基化检测。上述各组检测结果最终以病理学检查结果作为参照。

　　1.2.2、宫颈DNA提取、化学修饰与扩增

　　参照德国Qiagen公司生产的试剂盒说明书分别提取DNA与亚硫酸氢盐DNA后处理，然后进行PAX1基因转录。PAX1基因外侧上游引物：5'-AAGTTGATTTAGGGTTTGGGGT-3'；外侧下游引物：5'-ACCCAGCTCATCCACACTCCC-3'。PAX1基因上游引物：5'-GTGGAGACTGTGTCGGGAGGG-3'，下游引物：5'-AAATACCCRAGACTAAACGC-3'。采用生物素

　　标记下游引物5'末端。

　　1.2.3、焦磷酸DNA测序

　　参照焦磷酸测序仪（PyroMarkQ96ID焦磷酸测序仪，美国）中甲基化分析相关要求，首先制备单链DNA模板，然后进行焦磷酸测序。目的基因所用引物：5'-GGAGGTAGGTTTTGGAG-3'，可测得PAX1基因有9个胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤岛（cytosine-phosphoricacidguanine，CpGisland）。获得PAX1基因测序结果后，以单个基因所有检测位点的甲基化率的平均值表示每组样本的基因甲基化水平。经焦磷酸测序技术，对相关目的基因的9个不同位点进行甲基化定量测试分析。以试剂盒提供的通用DNA作为内参。不同位点检测标本中，某单一位点的甲基化水平与内参中该位点的甲基化水平的比值，用以表示该位点的甲基化发生率。

　　1.3、统计学方法

　　所有统计学数据均由SPSS17.0软件处理。计量资料以x±s表示，比较采用t检验；计数资料以%表示，比较采用χ2检验；绘制不同组别的接受者操作特征曲线（ROC曲线），通常以ROC曲线下面积进行比较。相关性研究使用散点图形式。检验水准为α＝0.05，P＜0.05表示差异有显著性。

　　2、结果

　　2.1、宫颈组织PAX1基因甲基化的定量分析

　　正常宫颈组、低级别病变组、高级别病变组、癌变组患者病变组织中PAX1基因相关位点甲基化水平分别为1.90%、2.10%、3.55%、4.66%，各组组间比较差异均具有显著性（P＜0.05）。

　　2.2、四组患者病变组织中PAX1基因甲基化水平的定量分析

　　四组患者病变组织中PAX1基因甲基化发生率和HPV阳性率比较差异均具有显著性（P＜0.05）（表1）。各组患者宫颈刮片和宫颈组织PAX1基因甲基化水平组间两两比较差异均具有显著性（P＜0.05）（表2），且癌变组患者宫颈刮片和宫颈组织PAX1基因甲基化水平显著高于其他三组（P＜0.05）。宫颈刮片与癌变组织PAX1基因甲基化之间的相关性分析见图1，r≥0.80表示宫颈刮片与癌变组织PAX1甲基化水平具有相关性（P＜0.05）。

　　2.3、PAX1基因甲基化水平诊断宫颈癌和CIN的相关性分析

　　3、讨论

　　临床上，从宫颈癌前病变发展至宫颈癌大多需要数年甚至几十年的时间。宫颈癌早期症状多不明显，待症状明显、恶性程度加剧时往往已属疾病的中晚期。因此，研究宫颈癌的发病机制，寻找有助于临床诊断和治疗的有效分子标志物对提高宫颈癌患者的生存率具有重要意义[6]。既往研究结果显示，宫颈癌变过程包括诸多基因及表观与调控基因的改变[4]，其中最重要的是以DNA甲基化为代表的表观遗传学改变，该过程主要表现为肿瘤抑制基因的启动子区域发生异常，导致目的基因及调控基因的转录失活，进而促使肿瘤的发生及发展；65%～95%的宫颈癌组织及细胞中可检测到DNA甲基化。因此，在宫颈脱落细胞及宫颈组织活检中，将基因甲基化作为一项检测指标有助于实现宫颈癌的早期诊断。

　　随着诊断技术的发展以及细胞学检查等技术的推广及普及，HPV病毒微量提取[7,8]与杂交法[9]的广泛应用，已使多种类型的宫颈癌前病变及早期浸润性宫颈癌得到诊治。统计分析表明，感染HPV者并不一定会发生癌前病变或宫颈癌，这提示在宫颈癌的发生及发展过程中，可能存在其他协同因子的共同促进效应。基于基因和蛋白水平的特异性检测方法应运而生。多项研究证实，癌基因的异常表达在多方面影响肿瘤的发生及发展（如细胞增殖与分裂的调控）；抑癌基因的异常甲基化（调控失调）亦可抑制抑癌基因的表达与下游基因的调控[10]。已有研究显示PAX1基因甲基化水平在宫颈癌组织中异常增高，并与启动子的甲基化相关，且PAX1基因甲基化可在宫颈癌患者的脱落细胞中被检测到[11-13]。还有研究显示，PAX1基因甲基化阳性率与宫颈癌的病理分级和淋巴转移等关系密切，因此PAX1基因有望成为宫颈癌早期诊断的分子标志物[14-19]。目前多数研究仅关注PAX1基因甲基化状态的定性检测，还难以进行精确地量化判断与评价。

　　既往研究发现，PAX1基因甲基化水平对宫颈癌的诊断有一定的帮助。Kim等[12]研究发现，PAX1基因甲基化检测可明显提高宫颈脱落细胞及活检组织检测的准确性，并且可替代50%的阴道镜检查和宫颈组织活检。Nikolaidis等[20]指出PAX1基因甲基化水平可作为宫颈癌早期诊断的一种辅助手段，其区分CIN2与正常组织的灵敏度与特异度分别为0.66和0.92；此外，PAX1基因甲基化的水平区分CIN3与正常组织的灵敏度与特异度分别为0.77和0.92，与其相对应的ROC曲线下面积分别为0.923和0.931，具有较高的诊断价值。

　　但既往研究未对患病类型进行区别诊断。本研究使用更为敏感而特异性强的定量分析方法，结果显示，癌变组PAX1基因甲基化发生率显著高于其他三组；宫颈刮片和宫颈组织中PAX1基因甲基化水平在各组之间差异均具有显著性，且癌变组患者PAX1基因甲基化水平显著高于其他三组。上述结果提示：通过PAX1基因甲基化发生率及其定量水平的测定，可以在一定程度上对宫颈癌高危人群进行筛选，并为后期定期随访观察提供依据。此外，本研究通过对PAX1基因甲基化水平鉴别诊断不同癌前病变人群与宫颈癌患者，结果发现其ROC曲线下面积为0.88，具有较高的诊断鉴别能力。当其在最佳阈值下，分析PAX1基因甲基化水平检测癌前病变与宫颈癌的灵敏度明显优于传统的宫颈脱落细胞形态学检测。本研究结果能够解决临床上基于PAX1基因甲基化的部分患者的诊疗问题，为临床治疗提供参考依据。

　　综上所述，定量检测宫颈组织细胞中的PAX1基因甲基化水平，用以诊断宫颈癌前病变具有临床应用价值。