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魔剪快速靶向!CRISPR/ Cas9基因编辑系统需满足这个条件!

2017-11-23 来源:转化医学网  标签: 掌上医生 喝茶减肥 一天瘦一斤 安全减肥 cps联盟 美容护肤
摘要: 解决这个问题的关键在于PAM(原始相邻基序“序列”),它们决定了Cas9分子打开DNA双螺旋的位置和速度。

   细胞定位由单链寡核苷酸指定的特定染色体DNA序列有多快?为了解决这个问题,研究人员调查Cas9蛋白在细胞内搜索过程,可以通过gRNA来编程,以结合基本上任何的DNA序列。这种靶向灵活性要求Cas9解开DNA双螺旋,以测试与gRNA的正确碱基配对。研究发现:一个荧光标记的dCas9需要6小时才能找到正确的靶序列。实验发现:Cas9及其gRNA在高浓度存在的情况下,可以实现快速靶向。

 
  CRISPR/Cas9基因编辑系统的优势在于其靶向机制的内在灵活性,但是也存在着内在性的搜索和剪切缓慢的缺点。而导致这个缺点存在的机制是由于在细菌的细胞中,指导蛋白gRNA(编码蛋白质的RNA)在最终到达目标DNA序列之前,需要花费一个很长的时间去寻找目标基因组,这个过程长达6个小时。乌普萨拉大学的研究人员在实验中发现:这个慢动力学的问题可以通过一种新的方法来解决,那就是使用高浓度的gRNA和Cas9。
 
  这篇论述提高CRISPR/Cas9基因编辑系统速度的文章发表在9月29日的《科学》杂志上面,论文题目为“KineticsofdCas9TargetSearchinEscherichiacoli.”
 
  文章作者写道:“Cas9必须将搜速的每个位点都解开才能够进行工作。我们通过结合单分子荧光显微镜和大容量限制保护测定法,来研究活体大肠杆菌中催化无活性Cas9(dCas9)搜索的机制。我们发现一个荧光标记的dCas9需要花费6小时才能找到正确的目标基因序列,这意味着每个潜在的目标搜索时间被限制在少于30毫秒。”
 
  在最初设计实验的时候,研究人员使用这两种方法来测量Cas9需要多长时间才能找到其目标序列。第一种方法显示:在细菌中,Cas9需要长达6小时的时间来搜索目标基因,即通过400万个碱基对来完成搜索。这种看起来不太靠谱的结果也可以通过第二种独立技术来验证。发现的时间与Cas9可用于测试每个位置的毫秒数量相关,研究人员可以通过实时追踪标记的Cas9分子来测量Cas9用于测试每个位置所消耗的真实时间。
 
  该研究的资深作者JohanElf博士说道:“我们的研究结果显示:Cas9有更大的灵活性的同时,付出的代价是花费更多的时间。因此我们觉得:为了更快地找到目标,是否可以使用更多的Cas9分子寻找目标DNA序列。”
 
  “大多数搜索DNA代码的蛋白质只能通过感测DNA双螺旋的外部来识别一个特定的序列,”Elf博士继续说道,“Cas9可以搜索一个任意DNA代码,但是要确定它是否在正确的位置,这就导致Cas9分子必须打开双DNA螺旋,并将序列与编程代码进行比较。而我们在研究中发现了一个令人难以置信的事情:Cas9分子在不使用任何能量的情况下仍然可以搜索整个基因组。“
 
  提高Cas9分子的浓度可以帮助研究人员在合理时间范围内找到正确的DNA序列,这可以解决目前科学家们在细胞研究中急需解决的几个重要问题。在我们的研究中,我们了解到了Cas9分子搜索目标DNA序列过程的性质,这就为科学家们提供了一条如何改进系统的重要线索。
 
  我们之前太过于强调Cas9分子的灵活性,但是,如果我们牺牲Cas9分子一部分的灵活性,但是它仍然有足够的能力用于编辑各种基因,而这样做的好处就在于:这样会提高Cas9分子搜索的速度,可以更快的使其应用于临床。
 
  Elf博士说道:“我们的研究结果给我们提供了一条很重要的线索——可以帮助我们如何实现Cas9分子更快速的检测DNA序列,以期推动其在医学上的使用。“
 
  解决这个问题的关键在于PAM(原始相邻基序“序列”),它们决定了Cas9分子打开DNA双螺旋的位置和速度。不需要打开DNA分子螺旋结构的分子剪刀不仅可以更快的找到目标基因,并且还会降低基因编辑副作用的风险。
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