专题笔谈│儿童血友病的前沿性诊断！

　　专题笔谈│儿童血友病的前沿性诊断！

　　摘要

　　血友病A（hemophiliaA）和血友病B（hemophiliaB）是X连锁隐性遗传性出血性疾病，遗传特点是男性发病、女性携带。血友病的基因诊断采用方法有DNA常规测序、聚合酶链反应（PCR）法、酶谱分析法、Southern印迹法。目前，临床上开展了FⅧ22内含子倒位分析，可作为重型血友病的筛选试验。产前诊断有助于减少血友病患儿出生率。而凝血因子抑制物的产生是目前造成替代治疗无效的根本原因。危险因素包括：有抑制物家族史、存在高风险基因突变、首次出血发作时强化治疗。不同血友病患者凝血因子的药代动力学（pharmacokinetic，PK）存在明显差异。除了考虑患者出血事件以外，PK参数应该作为预防治疗个体化调整的重要参考指标。相关参数包括半衰期、清除率、体内回收率（IVR）、曲线下面积（AUC）、峰浓度、谷浓度等。不同年龄、体重、血型及vonWillebrand因子（vWF）水平等都可能为其影响因素。上述进展有助于针对血友病患者进行个体化治疗策略调整。

　　关键词

　　血友病；基因；抑制物；药代动力学

　　血友病A（hemophiliaA）和血友病B（hemophiliaB）是X连锁隐性遗传性的出血性疾病，遗传特点是男性发病、女性携带。凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因（血友病A）或凝血因子Ⅸ（FⅨ）基因（血友病B）突变是确诊血友病的最直接依据，同时也有助于进行致病基因携带者的诊断和筛查。凝血因子替代治疗是目前血友病的主要治疗方法，而抑制物的产生则是目前造成替代治疗无效的根本原因。不同凝血因子产品其药物代谢动力学（pharmacokinetic，PK）差异较大，PK参数应该作为预防治疗个体化调整的重要参考指标。因此，基因诊断、抑制物检测及PK检测是目前血友病个体化治疗方案调整的重要依据。

　　1血友病A及基因诊断

　　血友病A的发病率为1/10000～1/5000，男性为主，女性患者罕见。其主要病因是由于FⅧ基因缺陷而引起的FⅧ因子含量不足或功能缺陷，最终导致凝血功能障碍。

　　1.1血友病A基因特点FⅧ于1982年和1984年分别被克隆，其长度为186kb，是人类最长的基因［1］。FⅧ位于X染色体的长臂末端（Xq28），其中包含26个外显子和25个内含子，外显子的长度在69～262bp，最长的为第14和第26外显子，长度分别达到3106bp和1958bp，由于26外显子不能被翻译，故14外显子是最长的能够翻译的编码序列，主要翻译B区；内含子共25个，长度207～32400bp，其中内含子22为最大，约为32kb。FⅧ的mRNA长度约9kb，编码2351个氨基酸的前体蛋白，经过修饰，最终成熟的FⅧ蛋白，含有2332个氨基酸。FⅧ蛋白的构成为A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2，FⅧ与vonWillebrand蛋白形成复合体后，在血浆循环中，不被快速破坏。

　　1.2FⅧ基因缺陷（结构和功能）基因缺陷将导致FⅧ基因含量下降或功能不足。引起FⅧ基因缺陷的原因有：全基因组重排、插入和基因片段丢失（可以从1bp到整个基因），基因突变（无义或错义）。到2012年为止，国际血友病A在线登记HADB（http：//hadb.org.uk）网站登记了5200个FⅧ基因变异，包括了插入、丢失和单个基因突变，新的基因变异仍在不断发现和认定过程中。研究表明，所有基因缺陷在人种之间并无差别，尽管这些基因缺陷皆有可能引起严重后果，但临床最常见的是FⅧ的22内含子倒位，不仅会导致重型血友病而且有极高的产生抑制物风险［2］。

　　1.3FⅧ基因诊断目前，出凝血疾病的基因诊断技术已经广泛用于FⅧ缺陷的诊断，可确定致病基因，也用于携带者筛查和高危人群的产前诊断；并有可能预测抑制物的产生及凝血第一和第二阶段的差异，对存在危险的致病基因进行家系分析；还可对vonWillebrand因子（vWF）缺乏的疾病进行临床分型；其他出血或血小板减少性疾病也可以通过基因诊断明确。通过寻找基因测序变化确定致病基因，在进行基因诊断时，首先必须收集全面的病史，重点是出血史和家族史，由于自发性基因突变的缘故，有1/3患者并无家族史。同时必须注意到，vWF缺乏的3和2N型为常染色体隐性遗传，在病史采集中应该注意。基因型必须与临床表型结合，才能构成基因诊断［3］。

　　目前，血友病基因诊断通常采取的方法有DNA常规测序、聚合酶链反应（PCR）法、酶谱分析法、Southern印迹法。对于被检测基因的正常序列和结构已经阐明的，可以通过PCR法或直接测序来测定致病基因缺陷，结果可靠，对于少数未能测定到突变的临床病例，可以采用多重连接依赖性探针扩增技术（MLPA）或竞争性荧光PCR（AccuCopy）技术，更加复杂的病例、未能测定的病例可以采用比较基因组杂交（CGH）及MLPA的方法结合临床进行分析。

　　二代测序加PCR序列捕获技术、MLPA有助于发现较大的缺失和重复。从外周血中提取DNA，测序，通过基因序列的变化发现致病基因，与临床医生沟通有助于报告新的发现。在具备先证者且家系完整时，利用致病基因内外的限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）作为特异分子遗传标记物，通过家系成员间的连锁关系确定血友病基因的遗传情况，可以进行DNA多态性SNP分析其遗传学变异是否致病。常用的方法有RFLP、可变数目串联重复序列（VNTR）、短串联重复序列（STR），从而提高诊断率，有组于新的致病基因位点的发现［4］。

　　目前，临床上普遍开展了FⅧ22内含子倒位分析，可作为重型血友病A的筛选试验，也是目前惟一用于临床诊断的直接基因检测方法。由于FⅧ22内含子倒位和其他一些基因突变常伴有抑制物发生，因此，测定阳性结果有助于预测抑制物的产生，便于更加合理地开展预防治疗。

　　1.4产前诊断产前诊断有助于减少血友病A（尤其重型）的出生率，对有家族史特别是已经证实为女性携带者怀孕后，产前诊断非常重要，有利于检出女性携带者及致病胎儿，在目前治疗技术无法治愈血友病A的情况下，终止妊娠、减少血友病A的发生率。一般检测可以在着床前展开，在受精卵6～8个细胞的胚胎期，获取胎儿DNA，通过PCR/FISH（原位荧光杂交）的方法，进行快速诊断，选择正常胚胎着床，该技术费用高昂且难度较大，不利于临床广泛开展。妊娠9～12周可通过绒毛膜活检；在妊娠12～16周可进行羊水穿刺；妊娠18～20周可在胎儿镜下取脐静脉血，测定FⅧ活性（FⅧ∶C）和FⅧ∶Ag。上述方法都存在流产的危险（0.5%～1.0%），需在妇产科医生的指导与配合下进行。利用流式细胞术（FACS）测定母体静脉血中的胎儿特异性单克隆抗体以确定胎儿性别，提供了早期、无创性产前诊断的方法。

　　1.5新的突变点发现FⅧ基因是人类最长的基因，由于存在着自发性突变，不断出现新的突变点，也不断有新的致病基因被发现、证实。目前主要通过英国临床基因科学协会（UKAssociationforClinicalGeneticScience，ACGS）对新的致病基因评估，网址：http：//www.acgs.uk.com/media/774853/，最终结果需通过DNA测序的方法加以证实，并结合临床加以证实，并最终进行报道。

　　2血友病B基因诊断

　　血友病B的发病率约为血友病A的1/4，约为1/30000，遗传规律与血友病A相同，重型比例大约占30%，低于血友病A。

　　2.1血友病B基因特点血友病B的FⅨ基因在1982—1983年被克隆，于1985年发表。FⅨ基因位于Xq27.1，长33kb，共有8个外显子，可以转录为2802bp的mRNA，最终翻译成415个氨基酸的成熟蛋白，分子质量大约为52ku。FⅨ蛋白由肝脏合成，为维生素K依赖因子，以酶原形式存在在血浆中。最终为激活的FⅪ或组织因子（TF）激活，发挥凝血作用［5］。

　　2.2FⅨ基因诊断基因诊断有助于发现与抑制物产生相关的特殊突变如大片段的插入，对“健康”携带者及其亲属的测定也可以协助诊断，提示特殊情况下（如手术、外伤）可能出血。与血友病A相同，目前可通过DNA扩增PCR的直接方法测定FⅨ的8个外显子、3’UTR区域、5’UTR区域及剪接部位有无突变，如果发现有突变位点，可以通过测序的方法加以证实。FⅨ基因突变将导致FⅨ蛋白结构和功能的异常，其突变形式包括单核苷酸的错配而导致错义及无义突变、小片段插入和缺失、大片段插入和缺失、剪接、复杂性重排和调节，其中错义突变占了最大比例（65%）。血友病B整个抑制物产生率只有1%～3%，但是大片段插入和缺失，占血友病B1%～3%，却导致了50%的抑制物产生，因此，大片段插入和缺失的检测在判定血友病B产生抑制物的临床意义中作用较大。由于10%～15%的携带者也会发生出血症状，目前认为可能与X染色体失活有关，因此，对携带者基因诊断也非常重要［6］。在国外研究的基础上，上海交通大学医学院附属瑞金医院针对中国人FⅨ基因内外各STR位点进行研究，提供了一个中国人有一定多态性频率的6个FⅨ基因STR位点，可用于检测不同的血友病B家系。

　　2.3产前诊断与血友病A相同，20世纪80年代中期FⅨ基因被成功克隆，因此开始了血友病B的产前诊断。20世纪90年代，开始通过测序方法测定家族性突变或携带者，目前临床已成熟应用。产前诊断在妊娠早期11～14周开始，羊膜腔穿刺术在中期的16～18周，晚期超过32周可以采取不同的方法，测定母亲血中游离胎儿DNA有利于性别的判定，减少侵害性检查。意大利血友病B的数据库记录了373例无血缘关系的患儿，同时通过这些信息发现了274例为育龄妇女携带者，其中52例携带者生出了血友病B的儿童。有85%接受了产前基因检测，8例在妊娠时出现出血表现；绒毛膜绒毛测定52例，羊膜腔穿刺术12例，胎儿DNA2例；产前诊断结果重型35例（67%）、中型4例、轻型5例、未知8例。因此，各种方法的产前诊断对女性患者及携带者妊娠有着重要的指导意义，并且能早期发现血友病B患者及严重程度。

　　2.4FⅨ基因公共数据库相同FⅨ基因突变表现相同的临床表型是血友病B诊断的基础。1990年全球的第1个FⅨ基因的公共数据库开始建立，到2013年6月为止，已经收集了1107个单独变异，包括了3118例临床病例报道，目前数据库仍然在不断更新过程中。可以通过该数据库分析基因突变与临床严重程度的关系，为临床个体化治疗提供依据，

　　3FⅧ和FⅨ抑制物及其检测

　　凝血因子替代治疗（即给予浓缩FⅧ或FⅨ制品）是目前血友病预防出血最有效的治疗方法，而抑制物的产生是目前造成替代治疗无效的根本原因，是血友病治疗中迄今为止难以克服的挑战。因此，当出血发作而常规治疗无效时应怀疑存在抑制物，特别是对于重型血友病患者。抑制物通常在补充治疗开始不久后即产生，是针对特定缺乏因子的抗体（主要为IgG）［7］。通常用Bethesda单位（Bethesdaunits，BU）衡量有FⅧ或FⅨ抑制物反应严重程度分类。根据BU高低可分为高应答者和低应答者。任何时候测定患者的抗体滴度均＞5BU/mL是高应答者［8］，此类患者每次接受补充治疗后抗体滴度均升高，2～3暴露日即开始产生抗体，7～21暴露日达高峰，即使不再暴露抗体也可能持续数年。高抑制物水平致使输注FⅧ制剂无效，通常需要停止对缺陷凝血因子的输注。低应答者的抗体滴度持续偏低（＜5BU/mL），可能会消失，且凝血因子输注后抗体滴度不升高［9］。此类患者在接受剂量变化很小的FⅧ补充治疗可能仍然有效。适用于FⅧ抑制物的许多原则同样适用于FⅨ抑制物。

　　3.1抑制物的发生率血友病A较血友病B患者更常产生抑制物，重型血友病A和B抑制物发生率分别为25%～30%和1%～5%［10-11］，主要发生在年幼儿童的治疗早期（如在前50暴露日内），而在中型、轻型血友病A患者中的发生率要少得多（3%～13%）［12-13］。抑制物产生的可能性随暴露日增加而降低，但永远不会完全消除。

　　3.2抑制物发生的危险因素宿主和药物因素均会影响抑制物形成的可能性。包括：（1）年龄：患者开始替代治疗时的年龄、治疗强度以及早期应用预防性治疗可能影响抑制物的形成。FⅧ抑制物产生风险有两个高峰，分别为儿童早期及老年时期［14］。在CANAL研究中发现，临床相关的抑制物形成似乎与初次治疗时年龄较早有关［15］。但调整治疗强度后，上述相关性基本消失。（2）基因类型：内含子22倒位为抑制物产生最常见的异常基因型，与小缺失或错义突变的患者相比，抑制物主要发生在具有大片段基因缺失和终止突变（stopmutations）的患者。具有基因倒位的患者其抗体形成有轻度升高［16-17］。（3）种族：种族也是抑制物产生的影响因素，有色人种抑制物的形成率为白种人的2倍左右［18］。（4）替代治疗产品和（或）剂量：产品的剂量强度和给药方案是抑制物产生的潜在危险因素［19］。抑制物发生的风险随暴露日数量增多而增加［20］。38、50及100暴露日后，抑制物发生率分别为5.3%、6.7%和13.3%。FⅧ替代治疗的产品包括血浆源性和基因重组制剂，两类产品在成分、纯度及潜在污染物方面有所不同。没有明确的证据证明基因工程产品在抑制物形成风险方面有明显差异，亦无比较不同产品的免疫原性或抑制物形成发生率的随机试验报道。现有证据多数表明，血浆源性及重组产品与抑制物产生方面的相关性是相当的［21-22］。

　　3.3风险评估来自先前未经治疗的连续重型血友病A患者的队列（CANAL研究）结果，被用以制定产生FⅧ抑制物的风险评分，风险评分包括以下危险因素［23］：有抑制物家族史评2分；存在高风险基因突变评2分；首次出血发作时强化治疗评3分。在初始研究队列中（332例），风险评分为0、2或≥3分时，患者的抑制物发生率分别为6%、23%及57%。一项64例患者的验证队列研究观察到了类似的发生率。值得注意的是，此评分需要患者经过治疗，对任何特定患者试图预测抑制物产生时，这一点是不利因素。

　　3.4抑制物出现后的临床表现血友病A患者FⅧ抗体的临床表现部分取决于疾病严重程度。一般来说，抑制物不会导致出血事件发生频率明显增加。然而，产生抑制物的患者接受预防性因子输注可能发生新的突破性出血，或可能不会根据以往经验预期那样自发性止血。有抑制物的患者止血可能更困难且易发生更多的肌肉骨骼并发症；这种情况下，由于存在急性和慢性滑膜炎，出血次数可能会增加［24］。抑制物使出血发作的治疗更困难。因此，当出血发作常规治疗无效时，应怀疑存在抑制物，特别是对于重型血友病患者。但是因子Ⅸ缺陷者抑制物的产生还可能伴有某些特定表现，包括全身性过敏性反应及肾病综合征。

　　3.5凝血因子抑制物的诊断和筛查目前为止，并没有抑制物筛查时机的标准化流程，不同专家的筛查方案各不相同，目前推荐的监测方案为：20暴露日之前，每3暴露日检测1次；21～50暴露日，每10暴露日检测1次；之后1年至少检测两次，直至第150暴露日；150暴露日以后，每6～12个月检测1次。150暴露日后对于血友病A患儿的抑制物检测每年至少1～2次，血友病B患者则根据临床需要进行检测。若出现治疗效果不如既往，首先应该考虑患者可能产生了抑制物，应进行凝血因子抑制物滴度测定。此外，患者接受手术前必须检测抑制物。

　　抑制物筛查实验：采用活化部分凝血活酶时间（activatedpartialthromboplastintime，APTT）纠正试验，即正常血浆和患者血浆按1∶1混合，即刻及37℃孵育2h后分别测定APTT值，并与正常人和患者本身的APTT进行比较，若不能纠正至正常应考虑可能存在抑制物。

　　抑制物确诊实验：FⅧ抑制物活性测定方法通常为Bethesda分析，既可确诊FⅧ抑制物又可定量抗体滴度。将患者血浆连续稀释与正常血浆混匀37℃孵育2h；然后用凝集法测定残留FⅧ的活性［25］。残留FⅧ活性为50%时的患者血浆稀释比例的倒数为抑制物的滴度（BU）。抑制物滴度越高，测定残留FⅧ活性需要的血浆稀释比例就越大。目前常用的是Nijmegan改进的Bethesda试验，因为这似乎可在试验中血浆连续稀释后通过增强内源性缓冲效果而提高试验特异性和可靠性，特别是当抑制物滴度较低时。为了避免血浆中残余FⅧ的影响，在患者血浆稀释前，于56℃孵育30min。

　　如果抑制物滴度升高应立即再次检测另一份血样标本确认，尤其是首次血样采集是通过肝素化通道时。某些情况下，需要确定是否存在狼疮抗凝物（lupusanticoagulant，LA），因为LA可干扰低滴度抑制物的诊断。目前尚无一种理想的检测方法可排除LA的干扰，如怀疑抑制物的存在应在当地机构进行全面检测，如果检测显示有LA存在，PK及随着时间连续检测可能有助于证实特定FⅧ抑制物是否同样存在。

　　4血友病的PK检测

　　PK主要是研究药物的吸收，分布代谢和最终的清除。血友病A和血友病B的标准治疗仍是FⅧ和FⅨ的替代治疗。迄今为止，替代治疗的剂量主要是根据患者体重和期望的凝血因子水平进行计算。但是不同患者凝血因子的PK参数存在明显差异，虽然一般认为FⅧ半衰期为8～12h，但是最近研究显示事实上FⅧ的半衰期变异较大，为6～25h［26］。更为重要的是，根据体重计算的凝血因子用量与PK参数无相关关系，并不能精确预测体内的凝血因子活性水平，也不能有效预防关节出血。如何优化血友病的预防治疗，除了考虑患者的出血事件以外，PK参数应该作为预防治疗个体化调整的重要参考指标，有必要基于不同的PK参数进行治疗剂量的个体化，以获得最佳成本效益比。

　　国际血栓与止血学会（ISTH）指南推荐，个体化PK模型的建立是通过单剂量输注50U/kgFⅧ、测定输注前及输注后10min、30min、1h、3h、

　　6h、9h、24h、28h、32h、48h的FⅧ∶C，计算机模拟获取PK曲线及相关参数［半衰期、清除率、体内回收率（IVR）、曲线下面积（AUC）、峰浓度、谷浓度等］而得。由于儿童取血困难，对于12岁以下的儿童推荐使用减量的PK检测方法，采用输注前0.5h内及输注后1h、9h、24h、48h共5个时间点的数据建立PK模型［27-28］。

　　针对患者的PK研究发现，不同个体间存在较大的差异，且年龄、体重、血型及vWF水平等都可能为其影响因素。接受单次输注30U/kgFⅧ的1～6岁血友病儿童，其FⅧ∶C降至1%的时间为43～77h，10～65岁组为51～110h。因此，针对不同半衰期的患者、应用不同给药频率（如保持体重70kg患者FⅧ∶C谷值在1.0%～1.5%，分别应用每日输注、隔日输注及每3日输注1次3种治疗方式）。由于结构及性质差异，不同凝血因子制剂在相同个体中的PK也不同。而儿童患者的凝血因子半衰期比成人短、IVR比成人小、清除率比成人高，且随年龄变化，应每2年进行1次PK评估以更新数据［29］。

　　传统预防治疗采用每周一、三、五给药方案的患者突发出血事件多发生在周末，依据凝血因子的PK特点改为隔日1次规律输注，并将输注时间改为晨起（使凝血因子的谷值落在活动最少的睡眠时段），并根据患者不同活动状态所需的凝血因子活性水平调整治疗方案，明显减少了出血事件的发生。目前的研究显示，应用PK指导个体化预防治疗，在维持相同目标因子水平的前提下，基于PK的给药模式与传统基于体重的给药模式在因子消耗量方面相比明显减低。应用PK指导的预防治疗组输注次数明显减少。有研究显示，在没有增加出血次数的前提下，基于PK参数缩短用药间隔使凝血因子用量减少30%。

　　但是对于血友病B，FⅨ的PK研究资料较少，FⅨ分子质量较小，FⅨ在循环中呈游离状态，广泛分布在组织间隙之中。接受FⅨ注射后，FⅨ活性增加0.010～0.014U/（mL·kg）。在年长儿或者成人，FⅨ的半衰期为18～34h，但是在幼儿，FⅨ的半衰期更短。

　　同时必须认识到，除了PK参数，不同临床出血类型、关节病变程度、活动方式乃至生活环境，都是决定预防治疗剂量时须考虑的因素。