【综述】以神经节苷脂GD2为靶点细胞免疫治疗神经母细胞瘤的研究进展！

　　【综述】以神经节苷脂GD2为靶点细胞免疫治疗神经母细胞瘤的研究进展！

　　神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)为节后交感神经系统胚胎性肿瘤，是儿童最常见的颅外实体恶性肿瘤[1]。NB发病早、恶性程度高、预后差，诱导化疗后仍有10%～20%的患儿发展为难治性NB[2]。尽管手术切除、放射治疗、化疗以及造血干细胞移植等多重疗法介入，NB患儿总体生存率已有所提高，但高危患儿临床预后仍不佳[2]，因此急需寻找新的治疗方法以降低该类患儿的病死率。神经节苷脂GD2属于神经节苷脂鞘脂类，在NB、尤因家族肿瘤、骨肉瘤等实体瘤中过表达，而在其他正常组织中限制性表达，理论上是针对NB免疫治疗的理想靶点[3]。既往研究以抗GD2的单克隆抗体治疗NB为主，由于鼠源性单抗的Fc片段具有免疫原性，导致治疗后强烈疼痛而迫使部分患者提前终止治疗[4，5，6]。近年来，构建GD2-嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)转染免疫细胞治疗NB[7]，以特异性识别肿瘤抗原(tumorassociatedantigen，TAA)和非主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)限制性杀伤靶细胞的特点，在细胞免疫治疗中具有较高应用潜力。现根据近年来GD2-CAR修饰免疫细胞治疗NB相关研究成果，从GD2-CAR构建、效应细胞选择、载体选择以及抗肿瘤性能优化等方面进行综述。

　　一、GD2-CAR构建

　　CAR基本结构由TAA的单克隆抗体单链可变区(single-chainvariablefragment，scFv)、跨膜区和胞内T细胞激活以及共刺激区组成；其中scFv包含重链可变区和轻链可变区，两者经铰链区连接[7]，跨膜区多为CD8α结构域。此外，CD3ζ包含的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)模体较FcεRIγ链更丰富，激活T细胞效能更高，在胞内信号肽结构选择上，采用CD3ζ链多于FcεRIγ链。因此，GD2-CAR相关研究主要针对scFv设计和胞内信号共刺激区组合上存在差异。

　　1.GD2-CAR基因scFv区设计：

　　新型的抗GD2单克隆抗体层出不穷，逐渐朝着不影响结合GD2的亲和力以及更低毒副作用的方向发展[8]，于是，针对GD2-CAR基因scFv区的设计多建立在已验证安全有效的单抗结构基础上。相关预临床试验以及Ⅰ期临床试验资料显示，采用鼠源性抗体14G2a较为广泛，其中Pule等[9]通过14G2a单克隆抗体确定GD2-CARscFv区序列，结合T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)ζ链构建第1代CAR-T细胞，早期临床试验结果显示，纳入组中在输注前具有明确肿瘤病灶的8例晚期NB患者，其中1例在输注CAR-T细胞第4个月达到完全缓解，随访12个月无肿瘤复发，3例发生部分缓解或发生肿瘤坏死迹象，预示GD2-CAR-T细胞良好应用前景。此外，一些研究组也开始选择人和(或)鼠嵌合抗体chl4.18而设计胞外抗原结合区[10，11]，但是以上两种单克隆抗体的选择应用优劣目前尚无定论。

　　2．GD2-CAR基因胞内信号区设计：

　　既往研究GD2-CAR胞内信号区设计发展历经第1代至第3代CAR-T细胞。经典的第1代CAR-T细胞主要以scFv-CD3ζ形式为代表，研究结果显示了其具有诱导T细胞激活以及较好抗肿瘤能力；Pule等[9]及Louis等[12]在Ⅰ期临床试验中给予CAR-T输注最大剂量达到了1×108细胞数/m2，但实时荧光定量PCR监测NB患者体内GD2-CAR-T细胞数量的维持存在时间不超过6周，维持增殖能力不足，可能是部分肿瘤活跃患者难以达到临床缓解的原因之一。

　　在第1代的基础上，第2代GD2-CAR-T细胞在CD3ζ结构域的上游融合了共刺激分子，如CD28、CD224(2B4)、CD137(4-1BB)的胞内部分。由于GD2-CD28-CD3ζCAR-T细胞针对GD2阳性NB细胞出现特异性增殖激活受限，Altvater等[13，14]不推荐单独加入CD28共刺激因子组合，随后提出采用2B4-CD3ζ模体，在不影响肿瘤抗原特异性情况下，能有效上调CD25、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等的表达，激活增殖效果比第1代明显增强。另外，4-1BB属于肿瘤坏死因子家族受体，由于4-1BB能激活下游的JNK、p38、MAPK和NF-κB信号途径，因此，近年来也有研究者在NB细胞免疫治疗预实验采用4-1BB作为共刺激信号分子[15，16]，在小鼠异基因移植NB模型中体现了其上调促细胞凋亡分子TRAIL、IFN-γ等介导细胞毒作用以及维持增殖活化的优良性能。

　　第3代GD2-CAR则在TCRζ上游同时融合2种共刺激分子，研究表明，scFv-CD28-OX40-CD3ζ组合信号相比scFv-OX40-CD3ζ和scFv-CD28-CD3ζ在诱导GD2-CAR在T细胞表面表达以及诱导克隆性T细胞增殖方面具有明显优势；同时第3代GD2-CAR体外诱导T细胞分泌IL-2、TNF-α的产量也多于单独采用OX40或CD28构建的第2代CAR-T细胞(P<0.01)[17]。另外，构建scFv-CD28-4-1BB-CD3ζ作为第3代GD2-CAR的相关研究结果[18]也显示两种共刺激分子组合模式能弥补第1代CAR-T细胞维持增殖能力不佳的缺点，而且相比第2代GD2-CAR-T细胞能更充分的激活T细胞发挥细胞毒作用，预示较好的临床应用潜力。

　　二、效应细胞选择

　　1．T细胞作为效应细胞：

　　传统细胞免疫治疗多以活化T细胞(activatedTcells，ATCs)作为CAR转导的效应细胞，CAR-T细胞输注前激活主要有以下3种方式：抗-CD3抗体OKT3联合IL-2共刺激；包被抗-CD3、抗-CD28的磁珠联合IL-2共刺激；或是由表达4-1BBL和Fc受体的人工抗原呈递细胞联合OKT3在IL-2存在下提供刺激信号[7]。有研究显示Epstein-Barr病毒(EBV)特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes，CTLs)输注鼻咽癌患者体内后可长期存在，并能有效清除肿瘤细胞[19]，因此，针对可能存在特异性病毒感染患者，GD2-CAR效应细胞优先考虑使用病毒特异性T细胞[12]，以期延长CAR-T在患者体内的生存时间。比较EBV-CTLs与ATCs，二者转染效率以及抗肿瘤能力保持一致水平，但是CAR修饰的EBV-CTLs在输注NB患者体内早期增殖效率远高于ATCs，并能同时靶向识别病毒感染细胞以及肿瘤细胞，保持临床达到完全缓解优于CAR-ATCs[9]。但是6周后，两者均降至低检测水平[9，12]，因此，效应细胞类型选择是影响效应细胞维持激活增殖能力以及长期在体存在时间的原因之一，还需要综合考虑其他因素的共同作用，以降低肿瘤复发可能。

　　2．NK细胞作为效应细胞：

　　近年来也有部分研究组采用NK细胞或自然杀伤T细胞[18]作为效应细胞。Esser等[10]体外实验以及小鼠体内实验均证明转导GD2-CAR的NK-92细胞系能通过类似抗体依赖细胞介导的细胞毒作用机制执行肿瘤细胞杀伤作用，由于CAR特异性识别GD2阳性肿瘤细胞，而弥补了NK-92FcεRⅢ抗体激活不足的缺陷。同时，NK细胞中GD2-CAR信号激活要求不受NK细胞表面抑制性KIR受体与肿瘤细胞表面MHCⅠ结合后产生的负性调节信号影响[11]，增加了NK细胞基因修饰和GD2-CAR表面表达的难度，但是NK细胞不具有MHC限制性，相比转导CAR基因效应细胞为T细胞而言，临床治疗无需分别采用患者个人效应细胞并每次单独进行CAR基因修饰，相比CAR-T治疗具有节省时间经济成本、提高治疗效率的优势。

　　三、载体选择

　　除了GD2-CAR基因构建方式以及效应细胞的选择不同，转染效应细胞的载体也存在病毒载体以及非病毒载体之分。载体类型不同直接影响转染效率高低，从而一定程度上决定了GD2-CAR在效应细胞表面表达效率高低与否。将CAR转导入效应细胞多采用逆转录病毒或慢病毒作为载体，从而获得长期抗肿瘤效应，避免CAR表达丢失。目前最常用的主要是致癌病毒载体、人免疫缺陷病毒慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体等[20]。而Singh等[21，22]则采用RNA非病毒载体方式通过电穿孔途径将CAR转导入效应细胞中，形成GD2-CAR瞬时表达模式，其CAR表达能力以及杀伤肿瘤活性与慢病毒转导方式相比不相上下，可以延缓疾病进展，但不能根除播散性NB。这也意味着RNA电穿孔转导方式需要多次输注，临床长程监测，但是相比慢病毒稳转的CAR-T细胞株所携带的致癌风险偏低。

　　四、其他优化策略

　　1．共表达细胞因子受体相关基因：

　　为了进一步优化GD2-CAR细胞免疫疗法抗肿瘤作用，降低肿瘤相关抑制机制，已有研究组在CAR基本结构中融合细胞因子受体基因。Perna等[23]将人全长IL-7Rα与GD2-CAR相衔接，成功诱导EBV-CTLs共表达GD2-CAR和IL-7Rα，在调节性T细胞(regulatoryTcell，Treg)存在条件下，通过IL-7刺激表现比IL-2刺激更佳的抗肿瘤效应，而且不受Treg细胞抑制性信号影响(GD2-CAREBV-CTLs由IL-2和IL-7分别刺激，34d小鼠Xenogen-IVIS系统显示肿瘤荧光强度分别为(2.4×108)&plusmn;(4×107)和(1.2×108)±(3×107)，P<0.05。除了降低NB患者体内异常Treg细胞的影响等方面的进展，另外研究显示编码GD2-CAR-T细胞共表达趋化因子受体CCR2b[24]，也提高了CAR-T朝肿瘤细胞部位归巢能力从而获得更高的肿瘤杀伤活性；抑或是共表达活化蛋白激酶Akt信号，降低CAR-T细胞凋亡，对抗肿瘤免疫逃避行为等[25]。

　　2．共表达抗肿瘤基质相关基因：

　　B细胞源性肿瘤CAR-T细胞治疗取得较好的疗效，实体瘤CAR-T细胞治疗效果却不尽如人意。主要是因为肿瘤相关免疫抑制微环境对CAR-T细胞的毒性作用以及肿瘤周围基质的存在使得CAR-T细胞与肿瘤细胞接触激活不足引起[26]。最新的相关研究显示，在GD2-CAR淋巴细胞治疗研究中发现体外培养的GD2-CAR-T细胞缺乏乙酰肝素酶(heparanaseenzyme，HPSE)，而使细胞外基质主要组成成分硫酸乙酰肝素蛋白聚糖降解减少；而CAR-T的乙酰肝素酶mRNA下调，是因为p53基因结合在HPSE基因启动子上而产生抑制转录效应，因此，通过在CAR-T细胞中编码共表达HPSE基因，从而提高其肿瘤CAR-T细胞浸润以及抗肿瘤活性[27]。

　　五、展望

　　GD2-CAR细胞免疫治疗神经母细胞瘤在前期研究中显示了较好的抗肿瘤效应，但与血液系统肿瘤细胞治疗相比尚有一定差距。相关机制研究揭示可能是由于肿瘤相关免疫抑制微环境中精氨酸酶活性过高抑制CAR-T细胞增殖、NB肿瘤相关巨噬细胞通过上调PD1链而辅助肿瘤细胞免疫逃避等[28]导致。因此，如何进行输注前一系列GD2-CAR细胞设计以及优化，构建GD2-CAR载体在效应细胞表面高效稳定表达，增强其肿瘤细胞接触以及激活增殖能力，延长在体生存时间，同时降低肿瘤相关免疫抑制微环境毒副作用，是GD2-CAR细胞免疫治疗NB的研究热点。此外，对于部分患者存在GD2抗原丢失或者出现周围神经痛等副作用，新的NB治疗靶点如L1-CAM、ROR1[29，30]的相关研究也陆续开展。GD2-CAR细胞免疫治疗能更安全有效的应用于临床治疗，需要更缜密的设计并权衡利弊，及时采取相应的措施以规避可能出现的治疗风险与毒副作用，从而达到改善高危NB患儿以及难治性NB患儿临床预后，提高远期生存率的目的。