HBsAg阳性孕妇行羊膜腔穿刺后乙肝的垂直传播风险

背景及目的：尽管经过恰当的免疫预防，HBsAg+孕妇所生婴儿中仍有5-10%发生了垂直传播（verticaltransmission，VT）。我们验证羊膜腔穿刺是否会增加乙肝的传播风险。

方法：采用病例对照研究，收集未行抗病毒暴露和完成恰当免疫预防的HBsAg+孕妇所生婴儿。通过对比是否行羊膜穿刺术的孕妇所生婴儿来评估VT率。定义出生后7-12个月HBsAg+的婴儿百分率为VT率。

结果：642名婴儿入选本研究，羊水穿刺组63名，未行羊水穿刺的其余579名中选出的相匹配的198名为对照组，两组进行对比。穿刺组VT率高于对照组（6.35%vs2.53%；p=0.226）。根据穿刺前孕妇HBVDNA水平，<500拷贝/ml，500-6.99log10拷贝/ml，和≥7log10拷贝/ml，进一步进行分层分析。当孕妇HBVDNA<6.99log10拷贝/ml时，穿刺组和对照组VT率没有统计学差异。当孕妇HBVDNA≥7log10拷贝/ml时，穿刺组比对照组VT率高（50%vs4.5%，P=0.006）。根据基线值风险分析，高病毒血症的孕妇施行羊水穿刺是HBV传播的风险因素（OR=21.3，95%CI：2.960-153.775）。

结论：HBsAg+且HBVDNA≥7log10拷贝/ml的孕妇施行羊膜穿刺术会显著升高VT发生率。HBsAg+的孕妇计划行羊水穿刺需评估VT风险，并根据HBVDNA水平分层分析。尚需进一步的前瞻性研究证明我们的发现。

前言

慢性乙型病毒性肝炎（chronichepatitis，CHB）感染与肝硬化和肝癌有流行病相关[1]。在亚洲国家，围产期传播或垂直传播（verticaltransmission，VT）是乙肝病毒（hepatitisBvirus，HBV）感染最常见的传播途径[2，3]。若不采取干预措施，80-90%围产期期间暴露HBV的婴儿可能进展为CHB[4]。已证实，出生后12小时以内接种HBV疫苗或免疫球蛋白IgG（HBIg），随后进行额外两次HBV疫苗接种，会使母婴传播率（mother-to-childtransmission，MTCT）从90%降至约10%[5，6]。然而，尽管有恰当的被-主动免疫预防，MTCT仍令人担忧。已报道，MTCT存在于8-15%的高HBeAg+（HepatitisBsurfaceantigen）孕妇所生婴儿中，这导致婴儿慢性感染及东南亚CHB的数量增加[5，7-10]。此外，近几年从亚洲到发达国家的移民极大推动了CHB在美国及欧洲的流行[11，12]。因此，进一步努力预防MTCT对全球控制HBV有重要影响。

以往的研究表明，产妇HBVDNA水平是MTCT的独立危险因素[7，8]。母亲HBVDNA水平在1，000，000拷贝（或200000IU）/ml增加免疫预防失败的风险，造成婴儿出生后感染CHB。当母亲HBVDNA高于阈值1，000，000拷贝/ml时，则产妇HBVDNA将与MTCT之间呈线性关系[7]。最近的一项研究表明，分娩方式也是对母婴传播的危险因素。阴道分娩较择期剖宫产更能增加母婴传播的风险[13]。然而，在HBeAg+的母亲中其他非病毒的风险因素没有被充分研究。侵入性操作如羊膜穿刺术理论上可导致HBV经过损坏的胎盘传播（特别是胎盘前置时）。在羊水中存在HBsAg代表子宫内感染或是在羊膜穿刺时被血液污染。由Ko等人做的早期病例对照研究观察发现HBsAg+的孕产妇是否行羊膜穿刺术对MTCT无显著影响[14]。Alexander等有类似的调查结果，21位CHB的孕妇行羊膜穿刺术（除一人外，均为HBeAg阴性），在婴儿出生后行相关免疫预防[15]。Towers等最近的一项研究评估乙型肝炎HBsAg+母亲的MTCT或检测新生儿脐带血标本中的HBVDNA[16]。他们总结了30例行羊膜穿刺术的孕妇和72例未行穿刺的孕妇的MTCT。然而，上述研究是一个有限的相对较小的样本量，且产妇HBVDNA水平是未知的。此外，在一些研究中婴儿未接受或未完成相应的免疫预防。

我们进行了一项大型病例对照研究，包括了四年里所有在我们的中心检查的孕妇。我们评估了羊膜穿刺术是否是HBV感染孕妇MTCT的危险因素。此外，根据产妇的HBVDNA水平不同，对不同层次的子集进行了分析。

资料和方法

人数与研究设计：这是一项单中心回顾性研究，评价2008年1月至2012年5月HBsAg+的母亲所生婴儿。机构审查委员会批准了该研究（批准号：BDHCMU-2012-1-18），知情同意免除。纳入此项研究的婴儿必须满足以下标准：（i）母亲是HBsAg阳性，（ii）在出生后注射乙肝疫苗和免疫球蛋白，并在6个月内完善另两次乙肝疫苗注射，（iii）在出生时检查乙肝病毒血清学，以后重复，至少在7个月-12个月内检查一次。排除标准如下：（i）母亲除乙肝外合并丙肝病毒、HIV、梅毒螺旋体或弓形虫感染。（ii）在怀孕前六个月内及妊娠期间行抗病毒治疗或免疫治疗。（iii）母亲没有在妊娠12周后定期产检，或没有监测乙肝病毒DNA水平。

数据收集和结果评估：用电子病历系统和医院的文件图表，有针对性的收集地坛医院妇产科病区门诊及住院部的资料进行回顾性分析。对有资格入选的受试者，相关的婴儿数据收集如下：人口信息，包括年龄、性别、是否单胎妊娠、妊娠时间（天）、出生体重、身高、出生1分钟Apgar评分，母乳喂养情况、在出生后完成三次乙肝疫苗注射。此外，记录婴儿HBVDNA水平，和乙肝疫苗接种剂量和HBIG注射时间。以及婴儿母亲的相关数据进行记录，其中包括分娩的年龄，产科相关既往史，现病史，分娩方式，丈夫乙肝的情况（研究婴儿的父亲）。既往所生的小孩的谷丙转氨酶（ALT）水平，乙肝病毒血清学指标，在怀孕期间HBVDNA水平，及行羊膜腔穿刺术的操作细节。在7-12月时婴儿HBsAg+被认为HBV感染。MTCT被定义为在所有婴儿中CHB感染婴儿所占百分数。接受羊膜腔穿刺的母亲与未接受羊膜腔穿刺的母亲所生胎儿的MTCT率对比。当描述引起免疫失败的危险因素，慢性乙型肝炎的婴儿被选定为“CHB病例”，那些没有感染的的婴儿被称为“正常对照”。婴儿实验组是根据他们的出生日期（30天）相匹配的情况下，有类似的基线值的羊膜腔穿刺术组。婴儿的对照组选择是与穿刺术组婴儿出生日期的基线值相配。根据HBVDNA的水平分层分析，评估在不同DNA水平羊膜穿刺术对MTCT的危险性。

婴幼儿免疫预防的时间表和实验室检测：在我们中心的护理标准，HBsAg+母亲所生婴儿在出生6小时内需肌注200IU乙肝免疫球蛋白，一个月后予以第二次注射。在出生6小时内、1个月、6个月注射乙肝疫苗。7-12个月后测HBV相关血清学检查。HBsAg+母亲所生婴儿在出生时收集静脉血及脊髓血样本。所有实验室的检测在医院的中心实验室进行。使用化学发光微粒免疫测定乙肝血清学相关。HBVDNA通过实时定量聚合酶链反应测试，可检测范围500拷贝到8log10拷贝/ml，谷丙转氨酶(alanineaminotransferase，ALT)水平是使用日立测试7600全自动生化分析仪，正常值上限（ULN）为40U/L。

统计分析：描述性资料以均数±标准差（SD）或百分比表示。连续型变量用t检验。分类资料用卡方检验，似然比检验或Fisher确切概率法和Logistic回归。多变量资料用单因素方差分析或RxC列联表的卡方检验。采用SPSS16.0统计软件进行分析。采用双侧检验，检验水准ɑ=0.05，p<0.05为差异有统计学意义。

结果：在研究期间我们中心有5591名母亲分娩，在当中进行筛选，642HBsAg+母亲及其婴儿符合纳入标准。其中63名婴儿出生前母亲曾行羊膜腔穿刺术，而其余579名孕妇未行。从579名未行穿刺的母亲当中选择198名（接近的出生日期和婴儿基线水平）。两组基线水平显示于表1。所有母亲均为亚洲人，年龄在18-42岁之间。两组孕妇产前HBsAg阳性率和丈夫HBsAg阳性率在数量上无差别。然而，与未穿刺组比，穿刺组HBVDNA水平较低，剖宫产率较高，年纪也更大。

在一般人群中，140例母亲中22例HBeAg+，118例分别在行羊水穿刺组及对照组。在141例母亲HBVDNA水平≥500拷贝/ml，23例在羊水穿刺组，118例在对照组中。行羊水穿刺术的条件主要为年龄大于36岁（35/63），血清甲胎蛋白（MSAFP）异常（28/63）；行穿刺的孕妇孕龄平均为19.42±1.71周。除了一个操作需要进行二次操作取得液体标本，其他穿刺均一次性成功。行两次操作的母亲分娩的婴儿未感染乙肝。操作后未出现相关并发症，并且穿刺过程中没出血。在这个队列中，婴儿在出生两个小时以内均接受乙肝免疫球蛋白及第一次乙肝疫苗，在一个月后行第二次乙肝免疫球蛋白注射，并在六个月内完成二、三次的乙肝疫苗接种。一般人群中的MTCT为3.42%（22/642），这与过去调查的MTCT一致，这些母亲在妊娠期间也同样未接受抗病毒治疗。

在63名行穿刺的母亲及198名对照组母亲所生的婴儿中收集详细的数据。两组婴儿的基线是匹配的，显示在表2。两组婴儿的性别、体重、身高、1分钟Apgar、出生时的HBVDNA，出生时的HBsAg、母乳喂养和妊娠周期无差别。在羊水穿刺组仍有一个较高的感染率（4/63）比对照组（5/198），即使没有统计学意义（6.3%vs2.5%；p=0.226）。此外，根据HBeAg分层，是否行穿刺传播率并没有显著差异。然而，有较高HBVDNA水平的母亲行羊水穿刺比未行穿刺者有更高的传播率。在母婴传播率队列中，HBsAg+的母亲和母亲的HBVDNA的检测水平示于图1。

划定母亲HBVDNA水平对是否行穿刺引起病毒传播的危险性。我们根据她们的HBVDNA水平分为＜500拷贝/ml，500-6.99log10拷贝/ml，＞7.00log10拷贝/ml三组进行比较分析。HBVDNA水平分为＜500拷贝/ml，500-6.99log10拷贝/ml，是否穿刺对传播率没有显著影响。然而，母体乙肝病毒＞7.00log10拷贝/ml时穿刺组的传播率（3/6）显著大于未穿刺组的传播率（3/67），（50%vs.4.5%；p=0.006）。每个子集分析母婴传播率于图2显示。

表3给出相关免疫失败因素。根据单因素采用Logistic回归分析，母亲HBeAg+和母亲的HBVDNA水平是婴幼儿HBV感染和免疫失败的危险因素。然而在此次研究中，剖宫产与低的母婴垂直传播率无关系。虽然在我们分析的队列中，母亲HBVDNA＜7.00log10拷贝/ml时并没有增加母婴传播的危险。但是HBVDNA＞7.00log10拷贝/ml时羊水穿刺与母婴垂直传播具有显著的相关性（OR=21.3；95%CI2.960-153.775p=0.002）。考虑到在单因素分析中HBVDNA水平是母婴传播的危险因素，羊膜穿刺术只在DNA水平较高时才是一个危险因素，多元分析是不可能进一步描述上述两种因素。

为了明确是否每个组中感染的婴儿基线不同造成MTCT的差异，我们评估了穿刺组及对照组中被感染婴儿的数据。在两组中免疫失败的病例无显著差异（表4）。本次研究中，我们还研究了胎盘位置与传播的关系。总胎盘前置率54%（34/63）。穿刺组有四个婴儿感染乙肝，他们的母亲均为前置胎盘（100%）。相比之下，对照组中感染婴儿的母亲胎盘前置率为40%（N=2/5）（图3）。虽然有趋势提示母亲前置胎盘婴儿感染乙肝的概率比没有前置胎盘的母婴更高，但在穿刺时是否前置胎盘没有统计学意义（11.8%vs.0%p=0.118）。

讨论：乙肝母婴传播可以发生在产前也可以发生在分娩时[5]。目前包括乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗的被-主动免疫预防方案对分娩时在HBV中暴露的婴儿很有效，其中乙肝免疫球蛋白在出生后2次完成，乙肝疫苗在出生后六个月内完成[17]。然而，仍有10%的婴儿未能免疫成功[7，8]。孕早期或中期暴露于HBV可能导致免疫预防失败，因为免疫预防对病毒的预防作用是不会减轻的[5]。最近，早期宫内传播通过在胚胎阶段感染男性精子或女性卵母细胞从而达到传播的研究被报道[18-20]。我们研究了一些婴儿的父亲的HBsAg（整个研究组4.2%，穿刺组3/63，对照组8/198）。九个被感染慢乙肝的婴儿中没有一个父亲为HBsAg+。我们的数据表明通过父亲的传播HBV比较罕见。

宫内母婴传播的其他机制包括：HBV通过母亲外周血循环至胎儿细胞或因为胎盘收缩毛细血管床撕裂导致胎儿和母亲的血液混合[21]。在怀孕早期经历早产威胁是常见的传播方式，但先兆流产与高的母婴垂直传播没有联系[22]。在我们的研究中，两名婴儿的母亲妊娠期间出现过先兆流产（一个在穿刺组中，一个在对照组中），均免疫失败并感染HBV。因先兆流产的母亲病例数极少，故不能评估这一因素对母婴传播影响。在我们的研究中三个存在前置胎盘的母亲（两个在穿刺组，一个在对照组）的婴儿没有感染乙肝。最后，像羊膜腔穿刺这种侵入性操作，理论上可能由于侵入时产妇感染的血液进入了胎儿循环或羊水中导致了婴儿感染。然而，很少有研究调查行羊水穿刺后MTCT的风险，有的这些研究都是小样本且定义不清的研究人群[14-16]。在台湾Ko等人早期的研究报告对比了HBsAg+的母亲行羊水穿刺与既往未行羊水穿刺母亲的传播率。第一组（n=35）是婴儿出生时脐带血的HBsAg+数量，第二组（n=32）在3个月到5年内婴儿HBsAg+数量。研究结论认为羊膜腔穿刺术不增加母婴垂直传播。然而，本次研究没有报告产妇的HBeAg状态，HBVDNA水平及婴幼儿的免疫预防情况。近日，亚历山大等人分析了21名接受羊膜穿刺术的母亲（HBeAg-的情况N=20/21）与其胎儿，胎儿均进行了免疫预防，并没有发现HBV传播[15]。这项研究没有对母亲HBVDNA水平的限制，且主要是HBeAg-的母亲。Tower等人评估了30例穿刺的孕妇和72例未穿刺孕妇。该研究人员指出在婴儿的血液样本中HBsAg或HBVDNA无明显差异。和之前的研究类似，没有显示孕妇HBeAg的情况及HBVDNA水平。

我们的研究收集了642名母亲与63名行穿刺母亲，实验证明羊水穿刺在HBVDNA＞7.00log10拷贝/ml时会增加传播风险。据我们所知，本研究是迄今为止最大规模的关于羊膜腔穿刺术的风险与孕妇HBVDNA水平和HBeAg状态分层的研究。在上面提到的研究中，研究者无法识别羊膜穿刺对高病毒载量的母亲是一个危险因素是有可能的，这主要是因为他们涉及的样本是HBeAg-或者病毒载量很低的母亲。此外，在我们队列中感染乙肝的母亲均年纪较轻，平均年龄26岁左右。35岁以上的可能已经通过免疫耐受阶段，呈现出低的病毒水平。我们相信，在我们目前的研究中，年轻的母亲所生的被感染的婴儿，为我们观察HBVDNA＞7.00log10拷贝/ml与MTCT之间的关系提供了机会。以往研究的结论基本反映了母亲HBVDNA＜7.00log10拷贝/ml的亚群。最近的研究表明，在HBeAg-或者病毒水平较低母婴传播的危险性非常低，大部分传播可以通过免疫预防阻断[7，8]。在这个对羊膜穿刺术是否影响MTCT的亚群体研究中，需要一组样本量非常大的实验组才能有助于证明羊膜穿刺术组与对照组这两组数据有统计学显著差异。在我们的亚组研究中，我们证明了羊膜腔穿刺是母婴传播及免疫失败的危险因素。我们的结果表明若行穿刺尽量避免母亲HBVDNA大于7.00log10拷贝/ml。高病毒载量的母亲行穿刺，需行8周短疗程的抗病毒治疗以在穿刺前减少病毒量[23]。深入学习抗病毒治疗的疗效和安全性是必要的。母亲胎盘前置可能会增加乙肝病毒传播的风险。然而，当我们比较前置胎盘和非前置胎盘行穿刺和不行穿刺时发现Fisher’sexacttest无显著差异。这个结果可能是由于每组感染HBV的婴儿数量较少，和必要的能力以达到显著的统计学差异。我们的结果表明，穿刺时胎盘前置有增加母婴传播的趋势，如果设想存在，未来仍需要研究验证。

我们确信我们的研究结果和临床非常相关，在临床实践中会影响高病毒血症母亲的相关管理。然而，我们的研究也有一些局限性。主要的局限性是我们的研究是一个单中心，非随机对照及回顾性研究，不允许基于目前的实验数据确定相关意见。进一步行前瞻性研究来验证我们的研究结果是必要的。此外，当我们要匹配两组婴儿的基线时，有一些孕妇的基线值无法匹配。对照组产妇HBVDNA水平的基线比穿刺组高，可能导致的后果是穿刺组的母婴传播率被低估。然而，这不会影响以HBVDNA分层的子集的母婴传播率。穿刺组平均年龄较对照组大，因高领孕产妇更有可能行羊膜腔穿刺术。最后，穿刺组剖宫产率高于对照组。如果在子宫收缩之前行剖宫产（择期剖宫产），则可以降低传播率[13]。因此，我们的羊膜穿刺组的传播率可能被低估。尽管我们有上述局限性，我们相信高病毒载量的母亲行羊水穿刺仍是母婴传播的重要风险。虽然在临床研究中，随机研究可以提供更高的证据水平，但为羊膜腔穿刺术的对照组设计随机对照研究仍然面临很大挑战，因为临床适应症为原则决定临床处理方案，而不是随机规则决定临床处理方案。此外，高病毒载量的母亲提前使用抗病毒药物在最近专家共识或实践指南中没有被支持[5，24]。尽管多临床中心的大样本回顾性队列研究能验证我们的结果，但我们目前研究中不足之处仍然很难避免。因此，我们相信，我们的数据是评价高病毒载量母亲行羊水穿刺后母婴传播风险的最佳证据。

综上所述，HBsAg+并HBVDNA＞7.00log10拷贝/ml行羊水穿刺会增加母婴传播的风险。乙肝病毒水平低的母亲传播风险仍具有不确定性，进一步控制研究因素可能需要更大的样本，进一步提供细节。胎盘前置的母亲行羊膜腔穿刺并没有显示出较高的传播风险较那些未穿刺的。正在考虑羊膜腔穿刺的HBsAg+的母亲，在穿刺前咨询乙肝病毒传播风险是强烈推荐的。HBVDNA水平应在穿刺前了解，并作为传播风险的一个重要因素分析分层。进一步前瞻性研究来确认我们的发现。