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构建Nicastrin基因沉默的细胞模型,深入研究反常性痤疮

2017-05-15 来源:中华皮肤科杂志  标签: 掌上医生 喝茶减肥 一天瘦一斤 安全减肥 cps联盟 美容护肤
摘要:采用慢病毒介导的shRNA作为载体,成功构建了稳定的靶向沉默NCT基因的人永生化角质形成细胞模型,为后续关于NCT基因对角质形成细胞的生物学行为及反常性痤疮的发病机制等相关研究奠定基础。

  反常性痤疮(acneinversa,AI)是一种慢性复发性炎症性疾病,约40%的患者有家族史,属常染色体显性遗传。2010年,王宝玺等对6个中国反常性痤疮家系进行全基因组连锁扫描结合单倍型分析,发现编码γ分泌酶不同亚单位的基因发生功能缺失突变可引起家族性反常性痤疮。γ分泌酶由4个亚基组成,分别为早老素(PS)、Nicastrin(NCT)蛋白、前咽缺陷蛋白1(APH1)、早老素增强子2(PEN2)。目前已在AI患者的NCT、PS1及PEN2基因上发现27个不同的突变位点,其中22个发生在NCT基因上,且均为功能缺失性突变。而NCT基因表达缺失在反常性痤疮发病机制中的作用还不明确。毛秋霞等通过构建慢病毒表达载体感染HaCaT细胞,获得NCT基因稳定下调的HaCaT细胞模型,为进一步探索NCT基因表达缺失在反常性痤疮发病机制中的作用提供实验基础。

  慢病毒介导shRNA沉默NCT基因的人永生化角质细胞模型的构建

  毛秋霞张婉璐何艳艳贾苇雪YangBrooks李莉李黎明张晓峰徐浩翔陈旭王宝玺李诚让

  作者单位:中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室[毛秋霞(现在南京中医药大学附属江阴医院)、张婉璐、何艳艳、李莉、李黎明、张晓峰、徐浩翔、陈旭、李诚让)];河南省人民医院皮肤科(贾苇雪);CutaneousBiologyResearchCenter,MassachusettsGeneralHospital(YangBrooks);中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院皮肤科(王宝玺)

  设计3个靶向NCT基因特异性短发卡RNA(shRNA)表达序列并连接到慢病毒表达质粒pGLV3/H1/GFP+Puro中,成功构建慢病毒重组表达质粒,并通过测序鉴定。将构建的重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒,并测其滴度。将HaCaT细胞分为空白组(未感染病毒)、阴性对照组(NC组,感染空载病毒LV3-shNC)和干扰组(分别感染NCT?shRNA1、2、3慢病毒)。流式细胞仪检测慢病毒转染效率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western印迹检测靶基因的沉默效率,筛选出沉默效果最佳的干扰序列。

  倒置荧光显微镜观察慢病毒在HaCaT细胞中的转染情况(×100)

  测序表明,NCT-shRNA慢病毒重组表达质粒构建成功。重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生的慢病毒颗粒滴度为109TU/ml。慢病毒感染HaCaT细胞后,流式细胞仪检测,慢病毒转染效率大于95%。qRT-PCR结果,与NC组相比,干扰组NCTmRNA表达量明显下降,其中NCT-shRNA1组NCT基因沉默效果最佳,干扰效率达到75%。Western印迹结果显示,与NC组相比,shRNA1组NCT蛋白表达抑制率为71.7%。

  总之,采用慢病毒介导的shRNA作为载体,成功构建了稳定的靶向沉默NCT基因的人永生化角质形成细胞模型,为后续关于NCT基因对角质形成细胞的生物学行为及反常性痤疮的发病机制等相关研究奠定基础。

 

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