【Nature Medicine】从外周血中分离识别肿瘤新抗原的淋巴细胞！

　　【编者按】恒瑞源正的MASCT多靶点自体免疫细胞技术及源正细胞neoantigens个体化肿瘤自体免疫细胞技术均是收集肿瘤患者的外周血中免疫细胞，通过DC负载抗原（包括neoantigens）特异性激活杀伤性T细胞，体外扩增后回输。最新一期SteveRosenberg小组发表在《自然-医药》杂志上的文章《Prospectiveidentificationofneoantigen-specificlymphocytesintheperipheralbloodofmelanomapatients》即是从晚期恶性黑色素瘤患者的外周免疫细胞中可根据PD-1受体表达找到针对肿瘤变异新抗原的活性杀伤T细胞。这样找到的T细胞在体外增殖后和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）一样可以识别患者自身肿瘤。以前收集这样针对肿瘤新抗原的活性T细胞需要肿瘤组织，但提取肿瘤组织比取血要困难很多。所以这个办法可能大大简化特异杀伤T细胞的生产。

　　淋巴细胞能够识别非自身的蛋白(抗原)并加以清除。对于肿瘤细胞来说，除了生殖系来源的突变（从父母遗传获得），往往还包含大量的体细胞突变。这些仅存在于肿瘤细胞体细胞突变被称为肿瘤的“新抗原”（Neoantigens）。但事实上，病人体内的肿瘤往往并不能被免疫细胞有效清除。其部分原因是免疫检验点蛋白（PD-L1,CTLA-4等）的表达降低了免疫系统的效率，使少量接触肿瘤组织的免疫细胞（淋巴浸润细胞，TIL）不能被有效激活、扩增（肿瘤细胞很”聪明”有没有！）。

　　基于此，一个简单的设想就是把肿瘤特有的Neoantigens作为靶标，通过分离病人自身可以识别neoantigens的一小部分免疫细胞，体外进行激活、扩增，然后再回输到病人体内，达到清除肿瘤的目的。

　　［经典回顾］

　　Rosenburg团队通过研究，证明晚期癌症患者的肿瘤组织中存在可以对抗肿瘤突变的淋巴细胞的、即便是在晚期胆管癌凶险又难治的瘤种。

　　Rosenberg团队建立的方法流程：

　　图示：以ERBBIPneoantigen突变为例的治疗流程概览。①对病人肿瘤样本进行测序，找到肿瘤特异的26个非同义突变。②分组串联构建这26个点突变的微小阅读框（tandemminigene，TMG）来体外转录成mRNA，然后转染到病人自己的抗原呈递细胞（DC细胞）使之被表达、加工并呈递给淋巴细胞。③分离肿瘤浸润的淋巴细胞（TIL）和转染抗原呈递细胞共培养，筛选有反应的TIL和TMG组合，最终鉴定出ERBBIP突变和匹配的CD4+Vb22+T细胞克隆。④体外大量扩增这种TIL，然后回输到病人体内。（KohS,etal.,2014）。

　　第一步，通过高通量测序的方法找到某个病人肿瘤组织特有的体细胞突变。一个前提就是不同的病人其肿瘤组织包含的突变往往是不同的，因此，需要针对每个人进行外显子组序列的分析鉴定，找到病人肿瘤特异的neoantigens。

　　第二步，鉴定这些neoantigens中哪些是有效的。分组串联体外转录，然后转染到病人自己的抗原呈递细胞使之表达加工呈递。

　　第三步，分离病人的TIL，和抗原呈递细胞共培养，检测哪些neoantigen和TIL克隆的组合可以识别反应。

　　第四步，体外扩增这种TIL，回输到病人体内。利用这种方法，几例黑色素瘤病人的反应非常好，有的病人体内的肿瘤完全被清除。但这里有一个技术上的问题：从病人肿瘤组织里分离TIL有限制，有时候根本得不到，这就限制了这一方法的使用。

　　［正文］

　　那么除了浸润在肿瘤组织中的T细胞，患者的外周血的T细胞是否也存在能够识别肿瘤的T细胞呢？如果有，我们怎么找到这些T细胞呢？这次发表在NatureMedicine上的文章，是Rosenburg博士团队的最新作品，就是解决这个问题的，在本研究中，作者试图从病人外周血中分离可以识别neoantigens的淋巴细胞（外周血取材不要太方便！）。

　　黑色素瘤中淋巴浸润细胞及新抗原特异性的淋巴细胞可以同时表达多种抑制性以及共刺激性受体，作者之前的工作发现CD8+TILs上表达的PD-1能够作为marker鉴定可以识别肿瘤细胞的淋巴T细胞群。所以他们考虑到能否用PD-1作为分子marker，来识别循环系统中黑色素瘤患者的neoantigen特异性淋巴细胞。

　　借助高通量个体化的筛选策略，作者从四位黑色素瘤患者的三人的外周血中成功检测到了新抗原特异性的淋巴细胞（Fig1）。

　　Fig1.循环和肿瘤滞留的淋巴细胞中PD-1表达量的比较；以及从循环的淋巴细胞中分离出对黑色素瘤neoantigen有反应的淋巴细胞。PBMC(peripheralbloodmononuclearcells，外周血单核细胞)中的循环淋巴细胞也有一部分（虽然很少）可以对肿瘤neoantigen有反应。这类淋巴细胞可以用PD-1阳性筛选出来。

　　a)PBMC和肿瘤来源的CD8+淋巴细胞中PD-1的表达量比较。b)肿瘤来源和PBMC来源的CD8+淋巴细胞中PD-1和TIM-3（左）、LAG-3（中）或4-1BB（右）共表达的情况。c)流式分选循环CD8+淋巴细胞时比例的选择。d-i)利用IFN-γELISPOT实验(d,f,h)和流式分选4-1BB显示呈递病人neoantigen的DC和不同的淋巴细胞组（CD8+,CD8+PD-1hi,CD8+PD-1?和CD8+PD-1+）共培养的情况。

　　虽然检测到的量比较低，但从这三名患者CD8+PD-1+（非CD8+PD-1?）细胞中成功检测到分别能够靶标3,3和1个特异性的新抗原的淋巴细胞（Fig2-3）。

　　Fig2.从病人NCI-3998分离的循环CD8+PD1+淋巴细胞可以特异性针对该病人的neoantigen起反应。该图主要描述一下分选出循环淋巴细胞的一些特征。比如可以特异性识别TMG1，TMG3和TMG5，并进一步鉴定出突变的肽段（分别包含MAGEA6E>K,PDS5AY>F;H>YandMED13P>S）(a)。而且这种识别是特异性的，因为这群富集的淋巴细胞对WT的肽段并没有应答（b）。进一步，通过在cos7共转染突变的微小基因和HLA基因，作者也鉴定了是哪种HLA来呈递这些突变的肽段(c)。通过deepsequencing作者富集了并鉴定CD8+PD1+循环淋巴细胞TRA和TRB基因中V-J或V-D-J可变区的序列，并把表达量最高的两种（A1，A2和B1，B2）互相组合通过逆转录病毒引入到PBMC中，这些PBMC能够识别对应的neoantigen(d,e,f)。

　　Fig3.被病人NCI-3784,NCI-3903andNCI-3713的CD8+PD-1+循环淋巴细胞靶向识别鉴定的neoantigens。类似的，从另外3位病人循环淋巴细胞分离出来的CD8+PD-1+淋巴细胞，可以识别多种neoantigens。特别的，NCI-3713这位病人在经过TIL治疗之后肿瘤完全消失。但作者从该病人治疗之前PBMC中分离出来CD8+PD-1+循环淋巴细胞同样可以识别突变产生的肿瘤neoantigen(e,f)

　　从外周血中分离的neoantigen特异性的T细胞和表达新抗原特异性T细胞受体（TCRs）的淋巴细胞都能够识别病人自身肿瘤。

　　值得注意的是，对肿瘤细胞识别的特异性和识别neoantigens的TCR库来说，外周血中来源和肿瘤组织中浸润的CD8+PD-1+淋巴细胞是类似的（Fig4），这暗示了循环系统中的CD8+PD-1+淋巴细胞能够作为一个展示肿瘤组织内部的抗肿瘤淋巴细胞的窗口。因此，外周血中PD-1作为一个分子marker可以用来鉴定分离多种特异性识别肿瘤细胞的淋巴细胞群。

　　Fig4.比较TCR和分离的特异性CD8+淋巴细胞对自身肿瘤的杀伤作用。作者利通过基因工程改造的方法把可以特异性识别病人NCI-3998三个nelantigens（MAGEA6E>K-,PDS5AY>F;H>Y-orMED13P>S）的TCR表达在T细胞中，或者利用病人NCI-3784和NCI-3903外周血来源并可以特异性识别neoantigen的CD8+T细胞分别和来自对应病人的肿瘤细胞系共培养，发现两种方法的淋巴细胞都表现出不错的肿瘤细胞识别能力（a-c）。在这5个独立的试验中，是循环CD8+PD-1+,而不是CD8+PD-1?淋巴细胞可以直接识别肿瘤细胞（d）。数据表明，循环CD8+PD-1+细胞群除了可以识别特异性的neoantigens，还能识别一些肿瘤自身其他抗原（非突变），比如NY-ESO-1，MAGEA3，SSX2，MART1，GP100和TYR（e,f,g）。作者还发现循环和肿瘤浸润的CD8+PD-1+淋巴细胞在识别肿瘤抗原能力上高度类似（h）。而且，deepsequencing表明二者TRB基因V-D-J区序列也高度一致（i）。

　　这项研究表明，黑色素瘤患者外周血中确实存在抗肿瘤活性的T细胞，这为肿瘤治疗性的研究提供了一种全新的无创策略。虽然占比小于5%的血液CD8+T细胞，但这群循环CD8+PD-1+T细胞确实可以全部识别4例黑色素瘤病人的肿瘤突变抗原和共有的抗原。

　　这提示，我们可以通过分离循环CD8+PD-1+T细胞或者利用neoantigen特异的TCR来定制个性化的细胞疗法。而且，还可以考虑和PD-1单抗联合用药。通过对固定的肿瘤病理切片、穿刺取样或液体活检得到的肿瘤样本进行全外显子测序，并结合本文的方法一起为T细胞为基础的细胞疗法提供了一种相对无创的系统性治疗方法。