骨质疏松相关信号通路的研究进展

　　骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以骨量降低，骨组织微结构破坏，导致骨脆性增加、骨强度下降，易发生骨折为特征的全身性代谢骨病[1]。OP患者在生命周期中有40％将发生脆性骨折[2]，这是骨质疏松最严重的后果；骨折愈合过程缓慢，恢复时间长，严重影响患者的生活质量[3]。OP是我国排名第四位的慢性疾病，也是中老年最常见的骨骼疾病，随着人口老龄化，OP患者现阶段已近1亿，预计2050年可达2.12亿[4]。目前，OP的诊疗现状可以用"三高三低"加以概括，即发病率高、骨折风险高、致残致死率高，诊断率低、治疗率低、治疗依从性低[5]。因此，探索OP的发病原因及分子生物学机制，对预防和治疗骨质疏松具有重大意义。近年研究显示，与OP有关的信号通路有丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt、Wnt/β-catenin、RANKL/RANK/OPG、Hedgehog和Notch信号通路。本文以"骨质疏松" 、"信号通路" 、"成骨细胞" 、"破骨细胞" 、"osteoporosis" 、"signaling pathway" 、"MAPK" 、"PI3K/Akt" 、"Wnt/β-catenin" 、"RANKL/RANK/OPG" 、"Hedgehog" 、"Notch"等为关键词，在CNKI、维普、万方、Pubmed、Springer等数据库中进行检索，重点筛选与骨质疏松相关信号通路有关的文献。

　　纳入标准：①骨质疏松发生、发展的相关文献；②成骨细胞和破骨细胞生理、病理的相关文献；③骨质疏松发生信号通路的相关文献；④发表时间在2008年1月到2016年相关文献。排除标准：①无法获取全文的文献；②中、英文以外语种的文献；③质量较低、证据等级不高的文献；④非重点研究骨质疏松的文献；共检索得到1 044篇文献，根据纳入及排除标准，排除980篇文献，重点阅读剩余的64篇文献。

　　本文通过对OP相关信号通路进行综述，旨在探讨OP形成的分子机制，以进一步深入研究新的作用靶点，获得更加安全、有效的抗骨质疏松药物。

　　一、MAPK信号通路

　　MAPK是一组丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，能被细胞因子、生长因子、神经递质、激素等细胞外信号刺激发生磷酸化而激活。MAPK通路主要包括MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase, MKK）和MAPK，分别又由不同亚族组成，MKKK由Raf亚族（B-Raf、A-Raf、Raf1）、MEKK亚族（MEKK1~4）、ASK1、MST等组成；MKK由MEK1/2、MKK3、MKK6组成；MAPK由ERK1/2、p38、JNK和ERK5等组成[6]。ERK信号通路：Raf同工酶B-Raf、A-Raf、Raf1→MEK1/2→ERK1/2；p38信号通路：ASK1、TAK1→MKK3/6→p38; JNK信号通路：ASK1、MEKK1→MKK4/7→JNK。活化的ERK、p38、JNK进入细胞核激活Ets-1、c-Fos、c-Myc等下游转录因子调节骨细胞增殖、分化和迁移等[7]。

　　p38 MAPK对转化生长因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）、骨形态发生蛋白-2 （bone morphogenetic protein-2，BMP-2）、Wnt蛋白、甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）和肾上腺素骨形成配体起作用，调节成骨细胞分化、胞外基质沉积和骨矿化；p38被肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）刺激作用于TNF受体调节破骨细胞分化，维持骨形成发育和稳态平衡[8,9]。ERK和p38 MAPK磷酸化成骨细胞分化的关键转录因子——Runx2调节成骨细胞分化；ERK激活RSK2磷酸化ATF4调节成骨细胞的生成[10]。Irisin治疗OP通过激活p38/ERK MAPK信号通路级联反应促进成骨细胞的增殖、分化[11]。ERK抑制剂PD98059抑制CH引起的COL1A1基因表达增加，表明ERK信号通路介导CH成骨活性[12]。Thouverey和Caverzasio[13]研究表明在雌激素缺乏的病理情况下，p38 MAPK信号激活促进成骨细胞产生核因子κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）和白介素（interleukin，IL）-6，骨吸收作用增强。敲除p38 MAPK信号通路可以预防雌激素缺乏引起的骨丢失。p38上游激酶MKK3和MKK6分别促进RANKL和IL-6、IL-17的生成，调节破骨细胞数量，从而影响骨质[14]。Choi等[15]研究显示matairesinol治疗OP的作用机制是抑制p38/ERK-NFKTc1信号通路抗破骨细胞的生成。

　　二、PI3K/Akt信号通路

　　PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，由调节亚基PIK3R、p85和催化亚基PIK3C、p110等组成。这些酶和下游Akt和mTOR在细胞分化、代谢、存活和增殖过程起重要作用[16]。PI3K/Akt信号通路高度保守，PI3K的激活为严格控制的多步骤过程[17]。细胞外信号与酪氨酸激酶和活化的Ras蛋白质受体结合激活PI3K，PIP2被PI3K磷酸化生成PIP3, PIP3与Akt的PH结构域结合使Akt募集到细胞膜上，mTORC2复合物及PDK1使Akt的Ser473、Thr308残基磷酸化激活，激活的Akt磷酸化下游转录因子调节细胞活动[18,19]。

　　LY294002特异性抑制PI3K/Akt信号通路，从而抑制成骨细胞增殖、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性、Ca2+沉积和OCN、Osterix、Runx2的mRAN表达，促进Caspase-3和Caspase-9 mRAN的表达。研究表明，PI3K/Akt信号通路通过促进成骨细胞增殖、分化和骨形成来抑制OP作用[20]。Wu等[21]研究表明，SWT治疗OP机制是激活PI3K/Akt和NF-κB信号通路，ALP、BMP-2和OPN基因表达增加，促进成骨细胞分化，增加骨形成。PI3K与下游信号RANKL、c-Fms、αvβ3整合素在破骨细胞存活、分化及骨吸收过程发挥重要作用。Cb1抑制PI3K活性，减弱破骨细胞骨吸收作用[22]。Liu等[23]研究显示酒精激活PI3K/Akt/mTOR信号通路的下游分子P70S6K，下调Runx2，减少BMMSCs的成骨分化，上调PPARγ，增加BMMSCs的成脂分化，引起OP。

　　三、Wnt/β-catenin信号通路

　　Wnt蛋白是细胞外富含半胱氨酸的糖蛋白大家族。目前，已知的Wnt信号通路有Wnt/β-catenin通路（canonical Wnt pathway）、Wnt /Ca2+通路和PCP通路。在脊椎动物至少发现有19种亚型Wnt蛋白，其中Wnt1、Wnt3a、Wnt8、Wnt10b参与经典的Wnt信号途径，Wnt5a、Wnt11、Wnt7a激活非经典的Wnt信号途径。在经典信号途径中，Wnt蛋白与Frizzled及LRP5/6受体结合成复合体促进GSK-3β磷酸化[24]，阻断β-catenin降解[25,26]，升高其在细胞质内的浓度，并转位进入细胞核内，与转录因子Tcf /Lef-1结合启动目的基因——c-myc、cyclin D1、MMP等的表达[27]，在增殖、分化、代谢和干细胞维持等过程中发挥作用。

　　Wnt信号通路是骨健康和骨疾病的重要调节剂[28]。经典Wnt/β-catenin信号通路可通过多种途径改变骨量，与骨质疏松关系密切[29]。Wnt/β-catenin通路（图2）增加Osterix1的表达促进骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向成骨细胞分化并抑制其凋亡；促进骨保护素（osteoprotegerin, OPG）产生而抑制破骨细胞分化[30]。敲除β-catenin后，可增加破骨细胞数量，增强骨吸收作用，从而减少骨质[31]。Jiang等[32]研究显示PEMF激活Wnt10b/LRP5/β-catenin信号通路，上调Wnt10b、LRP5、β-catenin、OPG和Runx2 mRNA及蛋白表达，下调Axin2、PPAR-γ、C/EBPα、FABP4和Dkk-1 mRNA及蛋白表达，治疗糖皮质激素性骨质疏松（glucocorticoid induced osteoporosis, GIOP）。另外，Fan等[33]用电针刺激CV4治疗绝经后骨质疏松（postmenopausal osteoporosis, PMOP），血清ALP和BGP水平增加，Wnt3α、β-catenin和Runx2表达水平增加，可能的作用机制是激活Wnt/β-catenin信号通路，促进骨形成。Jeong等[34]给OVX Wistar大鼠注射分泌Wnt3a的成纤维细胞，与对照组比较，血清骨碱性磷酸酶与骨钙素含量及β-catenin表达增加，说明Wnt3a/β-catenin可有效诱导骨形成。吕建伟等[35]认为柚皮苷可能通过上调骨膜素表达，进而抑制骨细胞表达骨硬化蛋白，促进Wnt/β-catenin信号通路激活，从而增加骨量，抑制失力学载荷导致的废用性骨质疏松发生。青少年Wnt1基因的c.652T→G （p.C218G）突变，减弱经典Wnt1/β-catenin信号通路的激活，成骨细胞功能相应减弱，骨密度减少，导致常染色体显性遗传早发型OP，增加椎体压缩性骨折发生频率。M?kitie等[36]建议对青少年做Wnt1基因检测并进行预防性治疗。

　　经典Wnt/β-catenin信号通路简易图示：Wnt蛋白与Frizzled及LRP5/6受体结合成复合体促进糖原合成酶激酶（Gsk3β）磷酸化，阻断β-连环蛋白（β-catenin ）磷酸化而抑制其降解，升高β-catenin在细胞质内的浓度并转位进入细胞核内，与转录因子——T细胞因子（T cell factor, Tcf）及淋巴增强因子（lymphoid enhancing factor, Lef）结合后启动目的基因c-myc、cyclin D1、Runx2、osterix的表达，引起骨髓MSCs的增殖和成骨分化

　　四、RANKL/RANK/OPG信号通路

　　RANKL是TNF超家族成员，也称TNFSF11或OPGL，主要由成骨细胞和"T"淋巴细胞分泌的跨膜蛋白组成[37]。OPG是TNF受体家族新成员，也称OCIF，主要在成骨细胞和血管细胞中表达[38]。RANKL与破骨细胞表面的RANK受体结合使TRAF-6在破骨细胞和OCPs中聚集，激活IKK/NF-κB、JNK、AP-1、c-Myc、c-Fos和NFATc1促进破骨细胞的分化和功能。OPG与RANKL竞争性结合，阻止RANKL与RANK结合，抑制破骨细胞功能[39,40]。

　　RANKL/RANK/OPG信号通路主要调节破骨细胞的分化和吸收活性，参与生理、病理骨重建过程[41]。TNFSF11和TNFRSF11A的单核苷酸多态性影响绝经后女性股骨头骨密度，表明RANKL/RANK/OPG信号通路的遗传变异决定骨骼是否健全[42]。-643C>T RANKL基因多态性影响体重和体重指数，可能是绝经后女性发生OP的原因[43]。Naranjo等[44]研究显示餐后RL-SFAs可增加TRAP活性，增加破骨细胞标志基因TRAP、OSCAR、RANK和CATHK的表达，增加TNF-α、IL-1β和IL-6破骨细胞生成因子释放，但下调OPG的表达；而TRL-MUFAs和TRL-PUFAs使IL-4和IL-10抗破骨细胞生成因子释放增加，表明膳食脂肪酸经RANKL/RANK/OPG信号通路可影响破骨细胞生成，MUFAs的摄入可预防OP的发生。RANK晶体结构环类似物L3-3B多肽，可特异性抑制RANKL，继而抑制RANKL介导的破骨细胞形成[45]。

　　五、Hedgehog信号通路

　　Hedgehog （Hh）有SHH、IHH和DHH三个同源基因，分别编码Shh、Ihh和Dhh蛋白。这3种蛋白与细胞膜受体Ptc和Smo结合发生级联反应。Hh信号通路高度保守，根据转录因子Gli是否参与而分为经典和非经典Hedgehog信号通路。经典Hh信号通路由PTCH1、SMO和Gli转录因子家族组成，Hh蛋白与PTCH1结合，解除对SMO的抑制，Gli与PKA结合使Gli蛋白转位进入核内，激活下游靶基因转录，表达参与细胞分化增殖等[46,47,48]。

　　Hh-Gli信号通路调节成骨细胞和破骨细胞的分化形成，在骨骼发育中起关键作用[49,50]。Shh激活Smo表达依赖的Gli1和Ptch1b转录，增加成骨细胞分化相关基因ALP和BSP表达。氧化应激和p-JNK1与Gli1相互作用抑制Shh的上述作用，但对Gli2、Gli3、Runx2、Osx和Bmp2的转录无明显作用，表明Shh信号经Gli1诱导早期成骨细胞分化不依赖Runx2/Osx表达[51]。Nakamura等[52]研究证明，Hh激动剂Hh-Ag 1.3 /1.7可通过激活Gli1的表达和促进MSCs向成骨细胞分化，可用于治疗OP。Shi等[53]研究显示，Hh信号通路可诱导Igf2表达，继而激活mTORC2-Akt信号，促进成骨细胞分化。雌激素缺乏扰乱MEK/ERK信号使Hh-Gli信号上调促进破骨细胞分化增殖，抑制破骨细胞凋亡导致PMOP。研究表明，抑制Hh-Gli信号可减少破骨细胞生成可能是雌激素治疗PMOP的机制[54]。

　　六、Notch信号通路

　　Notch信号通路由Notch受体、Notch配体（DSL蛋白）、CSL-DNA结合蛋白等组成。哺乳动物有4种Notch受体：Notch1、2、3、4, 5种Notch配体：Delta-like 1、3、4, Jagged1和Jagged2。Notch信号通路通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用，Notch蛋白经过蛋白酶水解，胞内段NICD释放入胞质，并进入细胞核与转录因子CSL结合，形成NICD/CSL转录激活复合体，从而激活靶基因HES、HEY、HERP等，调节细胞、组织、器官的分化和发育[55,56]。

　　Notch信号通路调节成骨细胞和破骨细胞的分化与功能参与骨重建过程[56]。使用Notch信号通路调节剂介导骨生成可治疗OP等骨病[57]。上调Notch信号增加M-CSF表达分泌，可促进hBMSCs向破骨细胞分化[58]。mTORC1通过激活Notch信号促进成骨细胞前体细胞增殖，但却阻止其分化，从而抑制骨形成[59]。范金柱等[60]研究Notch1信号通路关键分子Notch1、Jagged1和Hes1的表达，PMOP患者组hBMSCs的表达明显低于正常组，表明雌激素可能通过激活Notch信号通路发挥促成骨分化和抑制成脂分化的作用，Notch信号通路可成为治疗PMOP的新靶点。蚕丝蛋白能抑制Notch基因表达和阻止Notch特异性受体活化可对OP进行干预治疗[61]。

　　综上所述，以上6种信号通路在OP发病的分子机制中发挥重要调节作用。此外，与OP相关的还有GH/IGF-1[62]、PPAR-γ[63]、PTH[64]信号通路。以这些信号通路为作用靶点是研究开发新型抗OP药物或预防OP发生的新策略。但是，OP相关信号通路间存在交互或交叉作用，发病机制复杂，治疗困难。因此，骨质疏松形成的确切机制有待我们进一步深入研究，以获得更加有效、安全的抗OP药物。