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内蒙古地区蒙古族与汉族新生儿呼吸窘迫综合征相关性分析

2017-08-04 来源:中国小儿急救医学  标签: 掌上医生 喝茶减肥 一天瘦一斤 安全减肥 cps联盟 美容护肤
摘要:选择151例NRDS患儿(NRDS组)与151例正常新生儿(对照组)作为研究对象,应用PCR及基因分析技术检测186位点,分析其多态性与NRDS的关系。
  研究肺表面活性物质蛋白(surfactantprotein,SP)-C基因多态性,以186位点为重,研究内蒙古地区蒙古族与汉族新生儿呼吸窘迫综合征(respiratorydistresssyndromeofnewborn,NRDS)的相关性,分析两族是否具有基因位点差异性。
 
  方法
 
  选择151例NRDS患儿(NRDS组)与151例正常新生儿(对照组)作为研究对象,应用PCR及基因分析技术检测186位点,分析其多态性与NRDS的关系。
 
  结果
 
  在内蒙古地区,不论蒙古族还是汉族,SP-C基因186位点基因型均可检出3种基因型:即AA、AG及GG型。其中,蒙古族NRDS组和对照组患儿此3种基因型频率分别为:19.6%、33.3%、47.1%和23.5%、27.5%、49.0%,NRDS组和对照组A等位基因频率分别为36.3%和37.3%,G等位基因频率分别为63.7%和62.7%。汉族NRDS患儿和对照组此3种基因型频率分别为:14.0%、28.0%、58.0%和10.0%、30.0%、60.0%,NRDS组和对照组患儿A等位基因频率分别为28.0%和25.0%,G等位基因频率分别为72.0%和75.0%。内蒙古地区蒙古族与汉族NRDS患儿SP-C基因型及等位基因频率在不同性别、出生体重、胎龄、分娩方式等中无明显关联(P>0.05)。对比蒙古族与汉族NRDS患儿在SP-C基因186位点上基因型和等位基因分布,并未发现SP-C基因186位点多态性具有种族上的统计学差异(P>0.05)。
 
  结论
 
  内蒙古地区NRDS患儿SP-C186位点基因多态性无明显的种族相关性。
 
  新生儿呼吸窘迫综合征(respiratorydistresssyndromeofnewborn,NRDS)是新生儿期较常见的危重症之一,是导致早产儿疾病与死亡最主要的原因,也是导致儿童慢性肺疾病的主要原因。其发病机制主要是由于缺乏肺表面活性物质,导致肺泡表面张力增加,肺泡塌陷,临床表现为进行性呼吸困难,呼吸机参数要求较高但较难缓解[1]。NRDS的发病与多种因素密切相关,包括胎龄、性别、母孕期糖尿病等,其中胎龄关系最为密切,胎龄越小发病率越高,这与早产儿肺表面活性物质生成较少有密切关系。
 
  肺表面活性物质由肺泡Ⅱ型上皮细胞合成分泌,分布于肺泡表面形成单分子层,能降低肺泡表面张力,防止肺泡萎陷和肺水肿。肺表面活性物质主要由磷脂(约占90%)和肺表面活性物质蛋白(surfactantprotein,SP)(约占8%~10%)组成。其中SP包括SP-A、SP-B、SP-C、SP-D,SP在肺表面活性物质的功能和代谢方面都有重要作用。目前研究认为NRDS与肺表面活性物质中SP合成减少有很大关系。随着分子遗传学水平研究的不断进展,国内外研究表明SP-C基因突变和基因多态性与NRDS密切相关[2,3]。
 
  尽管目前导致NRDS易感的基因还不十分清楚,但SP基因多态性已受到国内外学者的高度关注,成为一个重要的研究方向。SP-C基因是到目前为止被发现的仅表达于肺泡Ⅱ型上皮细胞中的基因,SP-C位于人类第8号染色体的短臂上,包含6个外显子和5个内含子。成熟SP-C需要proSP-B参与,如果SP-B基因发生了突变就会导致SP-C异常,成熟SP-C含有35个氨基酸[4]。本研究设想通过PCR基因分析技术检测内蒙古地区汉族和蒙古族NRDS患儿SP-C基因多态性,着重研究汉族与蒙古族NRDS患儿与SP-C基因外显子5(S186N)位点多态性的相关性[5]。
 
  1对象与方法
 
  1.1研究对象
 
  NRDS组:2009年9月至2014年12月于内蒙古医科大学附属医院新生儿病房住院的NRDS患儿151例,其中汉族100例,蒙古族51例。NRDS的诊断依据第3版《实用新生儿学》NRDS诊断标准[6]。对照组:2009年9月至2014年12月于内蒙古医科大学附属医院新生儿病房住院的未发生NRDS患儿151例,其中汉族100例,蒙古族51例。对照组纳入标准:(1)X线胸片提示无肺部感染和NRDS表现;(2)血常规和C-反应蛋白检查提示无明确感染者。排除标准:NRDS组和对照组均排除:(1)严重先天性疾病,如复杂型先天性心脏病、膈疝和脑发育不良等;(2)遗传代谢性疾病,如苯丙酮尿症、先天性甲状腺功能低下和糖尿病等;(3)母孕后期有明确感染史;(4)多胎;(5)母亲糖尿病;(6)生后窒息。本研究通过内蒙古医科大学伦理委员会批准及家属均知情同意。
 
  1.2方法
 
  1.2.1标本采集、临床资料收集、基因组DNA提取
 
  抽取NRDS患儿及正常新生儿1ml静脉血,置于EDTA管中抗凝,-80℃冰箱保存。收集患儿性别、出生体重及胎龄等相关临床资料。严格按照基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)(购于北京博奥森试剂公司)说明书对样本提取DNA。将所提取的DNA置于-20℃冰箱保存。
 
  1.2.2PCR扩增
 
  SP-C基因全长分段扩增,每一对引物可扩增长度为700bp,引物委托北京安美生医药科技有限公司合成。依据引物说明书配置成100μmol/μl储存液,-20℃保存。分别取20μl引物储存液加入80μl的灭菌超纯水配置成20μmol/μl的PCR工作液备用。使用TAKARAPCRAmplificationKit(CodeNo.:DR011)进行PCR实验。从-20℃取出DNA样本、引物工作液、PCRAmplificationKit放置在冰上,融化后轻轻混匀,离心备用;按下列组成配制PCR反应液:10×PCRBuffer5μl,dNTPMixture4μl,PrimerF0.5μl,PrimerR0.5μl,TaKaRaTaq0.25μl,DNA500ng~1μg,加灭菌蒸馏水至总体积50μl。SP-C基因片段扩增的PCR反应条件:94℃10min,94℃40s,56~62℃30s,72℃40s,72℃7min,38个循环,4℃保存备用。
 
  1.2.3序列测定
 
  应用PCR基因分析技术对样本SP-C基因186位点进行序列测定。取待测序样本及上下游引物各20μl,干冰保存寄送至北京安美生医药科技有限公司对SP-C基因186位点进行序列测定。测序数据分析:应用NCBI数据库中的BLAST应用程序,将测序结果与数据库中的SP-C基因序列进行比对,确定基因多态性。
 
  1.2.4统计学分析
 
  使用SPSS17.0统计软件。两组患儿的性别、分娩方式、是否规律促肺成熟等进行χ2检验;出生体重、母亲年龄的比较采用t检验;SP-C基因186位点多态性的比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
 
  2结果
 
  2.1蒙古族及汉族患儿一般情况比较
 
  蒙古族NRDS患儿与对照组各51例,两组患儿性别、胎龄、出生体重、分娩方式、是否规律促肺成熟等方面比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。
 
  汉族NRDS患儿与对照组各100例,两组患儿性别、胎龄、出生体重、分娩方式、是否规律促肺成熟等方面比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表2。
 
  2.2SP-C基因186位点基因多态性的比较
 
  SP-C基因186位点多态性碱基序列图见图1,图2,图3。
 
  图1SP-C基因186位点AG型碱基序列图
 
  图2SP-C基因186位点AA型碱基序列图
 
  图3SP-C基因186位点GG基因型碱基序列图
 
  蒙古族NRDS患儿与对照组相比,两组SP-C基因186位点基因型均可检出3种基因型:即AA、AG及GG型。其中,蒙古族NRDS组此3种基因型频率分别为:19.6%、33.3%和47.1%,A等位基因频率为36.3%,G等位基因频率为63.7%。蒙古族对照组3种基因型频率分别为23.5%、27.5%和49.0%,A等位基因频率为37.3%,G等位基因频率为62.7%。SP-C基因186位点等位基因及基因型频率的比较两组间差异无统计学意义(P>0.05),见表3。
 
  汉族NRDS患儿与对照组相比,两组186位点基因型均可检出3种基因型:即AA、AG及GG型。其中,NRDS组此3种基因型频率分别为:14.0%、28.0%和58.0%,A等位基因频率28.0%,G等位基因频率72.0%。对照组3种基因型频率分别为10.0%、30.0%和60.0%,A等位基因频率25.0%,G等位基因频率75.0%。汉族SP-C基因186位点等位基因及基因型频率的比较两组间差异无统计学意义(P>0.05),见表4。
 
  2.3蒙古族与汉族NRDS患儿的一般情况比较
 
  蒙古族与汉族NRDS患儿在性别、胎龄、出生体重、分娩方式及是否规律促肺成熟等方面比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表5。
 
  2.4SP-C基因186位点多态性在蒙古族与汉族NRDS患儿中的分布
 
  蒙古族与汉族NRDS患儿相比,两组186位点基因型均可检出3种基因型:即AA、AG及GG型。其中,蒙古族NRDS组此3种基因型频率分别为:19.6%、33.3%和47.1%,A等位基因频率为36.3%,G等位基因频率为63.7%。汉族NRDS组此3种基因型频率分别为:14.0%、28.0%和58.0%,A等位基因频率28.0%,G等位基因频率72.0%。SP-C基因186位点多态性在两族NRDS患儿差异无统计学意义(P>0.05),见表6。
 
  3讨论
 
  SP-C基因的正常表达受很多因素的影响,包括肺器官的发育程度、激素水平的稳定、各个蛋白质转录因子及细胞因子的协调作用[7]。相对于机体内环境的影响因素外,SP-C基因自身的突变表现出不可确定性和多样性,Nogee等[8]首次描述了与肺部疾病有相关性的SP-C基因突变,该突变导致了exon4的缺失及proSP-CC端区域37个氨基酸缺失。随着研究进展,逐步发现外显子3、4、5是SP-C常见的基因突变位点[5],这些基因位点的改变导致SP-C基因表达的产物及SP-C的合成发生障碍或结构出现异常,进而导致婴幼儿甚至成人各种肺部疾病,尤以肺间质性疾病为主要表现。Bridges等[9]通过研究发现,过度表达的proSP-C突变体在转染细胞和转基因小鼠中可产生细胞毒性,细胞内质网受压,最终致细胞慢性损伤、细胞死亡,进而导致慢性间质性炎症和肺纤维化;另外,SP-C还参与了再摄取肺泡表面活性物质和分解代谢,同时激活肺泡中巨噬细胞的抗感染能力[10,11]。因此有理由推测SP-C基因突变参与肺部炎性改变过程。
 
  SP-C基因的突变可能存在地域、种族、环境的多样性。Poterjoy等[12]研究发现,SP-C基因在相应的区域表现出高度可变性,这种变化几率要高于SP-B。Wambach等[13]研究发现,SP-C基因启动子上的三个等位基因:g.-1167(G)、g.-1647(A)、g.-2385(T)与欧洲血统NRDS相关。芬兰相关研究发现SP-C外显子4(T138N)与外显子5(S186N)位点等位基因与NRDS有相关性[14],尤其更易增加男婴发生NRDS的几率。另外,国外的研究发现了c.298G>A突变,在SP-C基因的外显子3的第100密码子发生了GGC→AGC突变,引起甘氨酸被丝氨酸所替代,导致家族性肺纤维化[15]。SP-C基因突变与儿童和成人间质性肺疾病有相关性,其发病机制被认为是错误折叠proSP-C导致细胞毒性累积[16]。而朱春梅等[17]通过研究婴幼儿肺间质疾病发现,SP-C基因在编码区557位点发生的G→A杂合突变,该位点位于exon5区域。梅花等[18]研究发现,在内蒙古地区汉族NRDS患儿的SP-C外显子4和外显子5上均未发现基因突变现象,且SP-C基因外显子5(S186N)位点基因多态性与汉族NRDS无相关性。
 
  我国内蒙古地区地域宽广,幅员辽阔,本研究通过研究内蒙古地区蒙古族与汉族儿童SP-C186位点基因分布情况,试图探索该区是否存在基因方面的多态性变异,并由此导致NRDS患病率的不同。但并未发现两者之间有明显的相关性,原因可能是该地区蒙古族与汉族NRDS患病与SP-C186位点无明显关联性,也可能与样本量小等因素相关。NRDS是多基因、多因素引起的较为复杂的疾病,目前国内外缺乏统一的较大样本的收集和统计,因此有必要进行大样本、多民族、多中心、严密设计的研究支持,以期丰富少数民族基因库数据,为疾病的个体化预防和治疗提供依据。
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