寨卡减毒活疫苗成功研发背后的故事

 

本文第一作者单超博士，在史佩勇教授的指导下，自2015年底接手这项世界性难题，并与全球顶尖实验室合作，与时间赛跑，取得一系列重大突破。成果连续发表在CellHost&Microbe，EbioMedicine，NatureMedicine等顶级期刊。本文由单超博士供稿，他介绍了从事该项重大课题的心路历程和系列重要成果。

 

2015年以来，寨卡病毒在巴西等美洲国家持续传播。绝大多数寨卡病毒感染者症状温和，但孕妇感染寨卡病毒可能破坏胎儿大脑，导致新生儿小头症等缺陷。

 

因为寨卡病毒在巴西的持续传播，2016年2月1号，世界卫生组织宣布：寨卡病毒是紧迫的全球卫生问题！就在同一天，巴西卫生部下属位于帕拉州的埃万德罗·沙加斯研究院所长，医学病毒学家PedroF.C.Vasconcelos率领巴西代表团抵达德克萨斯大学寻求开展针对寨卡病毒疫苗的合作。因为史佩勇教授课题组在黄病毒研究领域的所取得的突出成果，他们直接与史老师进行对话，就合作事宜深入交谈。

 

如果想开展对寨卡病毒的研究和疫苗的开发，获得寨卡病毒的感染性克隆是第一步。黄病毒属的其它病毒如登革热病毒，日本乙型脑炎病毒，西尼罗病毒等均有感染性克隆。世界上有几个实验室可以进行这项工作，这就决定了构建感染性克隆就像赛跑一样，不能减速。2015年12月初，我们开始准备克隆寨卡病毒。因为史老师也是刚刚从新加坡来到美国，我们有实验室但是没有任何仪器，一直到2016年4月，在实验室另一个博士后谢旭平博士（同样来自于中科院武汉病毒所）的共同努力下，我们实验室才基本成型。因此我前期所有工作都是在UTMBGarcia-Blanco&Bradrick实验室完成的。在此表示感谢。

 

我们选取了2010年分离自柬埔寨一个三岁孩子的毒株进行克隆。根据其基因组序列，先把病毒基因组分成5个片段，然后克隆、组装成一个完整的病毒基因组，接着把克隆的基因组通过分子生物学的方法导入细胞，成功获得具有感染性的病毒克隆，该进展于2016年6月发表在CellHost&Microbe上。

 

小鼠实验显示，克隆病毒可以导致小鼠患病，它们会出现一些神经系统疾病的症状，这跟寨卡病毒可以引起人类的神经系统疾病类似。研究人员还做了克隆病毒的蚊子传播实验。结果显示，克隆病毒有着类似于母系病毒的传播效率。

 

此外，建立一种可以快速准确鉴定孕妇是否被寨卡病毒感染的检测方法迫在眉睫。由于病人被感染后，病毒血症持续的时间很短，血清学的检查对于确定病人是否被病毒感染就成为了一种很基本的方法。目前实验室所运用的检查方法是传统的噬斑减少中和检测（PRNT），这种方法步骤繁多，耗时耗力，一般需要等待一周以上才能得到检测结果，这也成了限制此方法广泛利用的一个瓶颈。因此我们构建了含有报告基因的寨卡病毒。应用报告病毒检测技术可以将样本的检测时间缩短的2天，相比于传统的PRNT所需的7天，大大缩短了检测周期。将此方法与目前的实时定量PCR联合使用，可以快速的检测出病人是否有寨卡病毒感染，对于后期的治疗等具有很重要的指导意义。该研究结果于2017年3月发表于EbioMedicine。

 

在获得了寨卡病毒的感染性克隆以后，我们便加紧开始寨卡病毒减毒活疫苗的工作。根据目前现有的文献，我们首先选取了和目前进入临床III期登革热病毒减毒活疫苗类似的策略。这个策略是对病毒基因组的3’非翻译区进行部分删除，从而得到毒性减弱的病毒，进一步获得减毒活疫苗的候选者。

 

很快，我们获得了寨卡病毒的突变株，并通过小鼠实验验证了突变病毒的毒力，小鼠实验显示我们得到的突变体在小鼠体内的病毒血症远远低于野生型病毒。这证实了我们得到了毒力减弱的寨卡病毒。

 

之后，我们想知道对小鼠起到保护作用所需要的最少的病毒量。我们对小鼠一次免疫10个，100个或10000个减毒活疫苗，结果显示这三个剂量均可以引发小鼠的免疫反应，并帮助小鼠防范寨卡病毒的感染，从而对小鼠起到保护作用。

 

此外，研究人员还验证了减毒活疫苗的安全性。他们利用仅出生一天的小鼠进行安全性实验，结果显示直接向初生小鼠脑部注射10000个减毒活疫苗不会导致初生小鼠的死亡。由于寨卡病毒感染会影响男性生殖系统，小鼠实验显示减毒活疫苗不会影响小鼠精子的活力和数量。因为寨卡病毒是通过蚊子传播，因此他们也验证了减毒活疫苗是否能被蚊子传播。蚊子的实验结果显示，减毒疫苗不能被蚊子传播。该进展发表于2017年4月NatureMedicine上。

 

目前已有一些针对寨卡病毒的其他类型疫苗进入临床试验，比如由美国国家过敏症和传染病研究所研制的脱氧核糖核酸（DNA）疫苗等。一般来说，DNA疫苗、灭活疫苗等其他类型需多次注射才能起到免疫作用，而减毒活疫苗可以利用一次免疫，小的剂量引发机体的免疫反应，并达到终身免疫的效应，对于以后的大规模的生产和使用是一大好处。尤其对于广大的发展中国家，将会是一种成本低，高效的选择。寨卡病毒属于是黄病毒属的一员，目前市场针对于黄病毒属的疫苗，黄热病毒，日本乙型脑炎病毒和登革热病毒的疫苗均是减毒活疫苗。研究人员希望接下来能开展临床试验。该项目是通过美国和巴西政府合作的，旨在开发出能有效防范寨卡病毒的疫苗。

 

寨卡病毒的疫情决定了对其的科研需要加速。而这些工作的完成，不能靠一个人一个实验，我们很幸运的得到了来自UTMB诸多实验室各个方面的帮助，与UTMB的ScottWeave实验室，NicolsVasilakis实验室，AlanBarret实验室和TianWang实验室进行合作，开展蚊子，小鼠和免疫学相关实验，保证了我们在最短的时间得到最好的结果，从而在寨卡病毒疫苗的研发上交出了一份满意的答卷。整个过程也不是一帆风顺的，寨卡疫情一波未平一波又起，攻克该课题的实验室国际上有很多，大家都在争先恐后，与时间赛跑。要说心得体会，就是静下心来，排除一切干扰因素，瞄准目标，保持长时间专注，勇往直前。

 

该论文的第一作者为博士后单超，2014年毕业于中国科学院武汉病毒研究所张波研究院课题组。从事寨卡病毒、西尼罗河病毒等流行病研究，相继在CellHost&Microbe、NatureMedicine、EbioMedicine、ACSInfectiousDiseases等以第一作者发表多篇论文。

 

通讯作者史佩勇，目前任职于德克萨斯大学医学分部特聘教授，同时受聘为美国杜克大学-新加坡国立大学教授，中囯科学院武汉病毒所特聘研究员，并担任国际三大病毒学杂志及自然疫苗子刊编辑和编委，VirologicaSinica编委。在世界顶尖杂志上发表200多篇学术论文，并取得多项世界级专利。

 

参考文献：

 

ShanC,XieX,MuruatoAE,etal.AnInfectiouscDNACloneofZikaVirustoStudyViralVirulence,MosquitoTransmission,andAntiviralInhibitors.CellHostMicrobe,2016Jun8;19(6):891-900.

 

AbstractTheAsianlineageofZikavirus(ZIKV)hasrecentlycausedepidemicsandseveredisease.Unravelingthemechanismscausingincreasedviraltransmissibilityanddiseaseseverityrequiresexperimentalsystems.WereportaninfectiouscDNAcloneofZIKVthatwasgeneratedusingaclinicalisolateoftheAsianlineage.ThecDNAclone-derivedRNAisinfectiousincells,generatingrecombinantZIKV.TherecombinantvirusisvirulentinestablishedZIKVmousemodels,leadingtoneurologicalsignsrelevanttohumandisease.Additionally,recombinantZIKVisinfectiousforAedesaegyptiandthusprovidesameanstoexaminevirustransmission.TheinfectiouscDNAclonewasfurtherusedtogeneratealuciferaseZIKVthatexhibitedsensitivitytoapanflavivirusinhibitor,highlightingitspotentialutilityforantiviralscreening.ThisZIKVreversegeneticsystem,togetherwithmouseandmosquitoinfectionmodels,mayhelpidentifyviraldeterminantsofhumanvirulenceandmosquitotransmissionaswellasinformvaccineandtherapeuticstrategies.

 

ShanC,XieX,RenP,etal.ARapidZikaDiagnosticAssaytoMeasureNeutralizingAntibodiesinPatients.EBioMedicine,2017Mar;17:157-162.

 

AbstractThepotentialassociationofmicrocephalyandothercongenitalabnormalitieswithZikavirus(ZIKV)infectionduringpregnancyunderlinesthecriticalneedforarapidandaccuratediagnosis.DuetotheshortdurationofZIKVviremiaininfectedpatients,aserologicassaythatdetectsantibodyresponsestoviralinfectionplaysanessentialroleindiagnosingpatientspecimens.ThecurrentserologicdiagnosisofZIKVinfectionreliesheavilyonthelabor-intensivePlaqueReductionNeutralizationTest(PRNT)thatrequiresmorethanone-weekturnaroundtimeandrepresentsamajorbottleneckforpatientdiagnosis.Toovercomethislimitation,wehavedevelopedahigh-throughputassayforZIKVanddenguevirus(DENV)diagnosisthatcanattainthe"goldstandard"ofthecurrentPRNTassay.Thenewassayishomogeneousandutilizesluciferasevirusestoquantifytheneutralizingantibodytitersina96-wellformat.Using91humanspecimens,weshowedthatthereporterdiagnosticassayhasahigherdynamicrangeandmaintainstherelativespecificityofthetraditionalPRNTassay.Besidestheimprovementofassaythroughput,thereportervirustechnologyhasalsoshortenedtheturnaroundtimetolessthantwodays.Collectively,ourresultssuggestthat,alongwiththeviralRT-PCRassay,thereportervirus-basedserologicassaycouldbepotentiallyusedasthefirst-linetestforclinicaldiagnosisofZIKVinfectionaswellasforvaccineclinicaltrials.

 

ShanC,MuruatoAE,NunesBT,etal.Alive-attenuatedZikavirusvaccinecandidateinducessterilizingimmunityinmousemodels.NatMed.2017Apr10.

 

AbstractZikavirus(ZIKV)infectionofpregnantwomencancauseawiderangeofcongenitalabnormalities,includingmicrocephaly,intheinfant,aconditionnowcollectivelyknownascongenitalZIKVsyndrome.AvaccinetopreventorsignificantlyattenuateviremiainpregnantwomenwhoareresidentsofortravelerstoepidemicorendemicregionsisneededtoavertcongenitalZIKVsyndrome,andmightalsohelptosuppressepidemictransmission.Herewereportonalive-attenuatedvaccinecandidatethatcontainsa10-nucleotidedeletioninthe3'untranslatedregionoftheZIKVgenome(10-delZIKV).The10-delZIKVishighlyattenuated,immunogenic,andprotectiveintype1interferonreceptor-deficientA129mice.Crucially,asingledoseof10-delZIKVinducedsterilizingimmunitywithasaturatedneutralizingantibodytiter,whichnolongerincreasedafterchallengewithanepidemicZIKV,andcompletelypreventedviremia.TheimmunizedmicealsodevelopedarobustTcellresponse.Intracranialinoculationof1-d-oldimmunocompetentCD-1micewith1×104infectiousfocusunits(IFU)of10-delZIKVcausednomortality,whereasinfectionswith10IFUofwild-typeZIKVwerelethal.Mechanistically,theattenuatedvirulenceof10-delZIKVmaybeduetodecreasedviralRNAsynthesisandincreasedsensitivitytotype-1-interferoninhibition.Theattenuated10-delZIKVwasincapableofinfectingmosquitoesafteroralfeedingofspiked-bloodmeals,representinganadditionalsafetyfeature.Collectively,thesafetyandefficacyresultssuggestthatfurtherdevelopmentofthispromising,live-attenuatedZIKVvaccinecandidateiswarranted.