拉曼光谱在皮肤病的应用进展

自20世纪20年代发现拉曼散射现象以来，由于其效应较弱，应用受到限制，直到1960年，激光技术的出现才使拉曼技术复兴。目前拉曼技术与显微分析成像技术相结合，直接获得分子结构振动的指纹图谱信息，从而可以在特定显微条件下实现单分子水平的检测，并且其具有选择性好、灵敏度高、快速、原位、实时和非侵入等优点。

常规拉曼光谱技术主要是傅立叶变换拉曼光谱技术，傅立叶变换的干涉仪型光谱仪克服了荧光干扰，因此，对荧光强、颜色深的样品更适用。此外，常规拉曼技术还有声光拉曼、高温高压原位拉曼技术。为了增强拉曼效应，解决在微量和痕量分析时较困难的弱点，人们开发了增强拉曼光谱技术，分为表面增强拉曼光谱和共振拉曼光谱。前者指在金属胶粒和粗糙金属（如银、金、铜等）表面作用，后者是指当激发光波长与分子的电子跃迁波长相等时发生共振拉曼散射，增强拉曼散射强度比常规拉曼散射要高出104～106倍，可用于低浓度和微量试样的检测。但拉曼光谱目前仍有局限，如在一些成分复杂的基质中，拉曼信号在一定程度上会受到干扰，因此发掘出具有更高特异性和灵敏度的分子识别模式是学者们的研究课题。

1.拉曼光谱应用于皮肤病

1.1拉曼光谱应用于皮肤组织的鉴定：

拉曼光谱可凭借其特异性好、灵敏度高的特点，成为皮肤病的新一代检测手段。拉曼光谱能在分子水平上鉴定正常皮肤结构，2011年，有学者就利用拉曼光谱对表皮细胞（黑素细胞、角质形成细胞）和真皮细胞（成纤维细胞）进行分子水平比较，研究表明，在波谱上，表真皮细胞有不同的成分高峰（如955cm-1、1079cm-1标记为胆固醇、956cm?1标记为角蛋白，870cm-1标记为胶原蛋白）。此外，拉曼光谱为不同的人体皮肤提供特征性描述，包括经表皮失水量，水合反应，pH，保湿因子相对量，脂肪酸和胆固醇量，结合多参数分析以测量不同皮肤特征，了解皮肤病学诊断的生理变化，并提出可能出现的病理特征。2013年，Ali等将拉曼光谱与k?均值聚类分析相结合阐明了人体皮肤组织切片的细胞结构和组织经过处理后（甲醛固定，石蜡包埋随后脱蜡）的变化，他们发现在未经处理的组织切片中角质层油脂，真皮层的胶原蛋白含量均较丰富，而经过处理的组织切片油脂含量少，各皮肤解剖层也变得难以区分，拉曼光谱对于新鲜皮肤中脂质的研究具有优势（如伤口愈合），对经过处理的皮肤组织切片中的细胞及蛋白质的研究具有优势，因此，拉曼光谱可用于皮肤病的进展和回顾性分析。拉曼光谱可以作为一个优势工具，实现一个可重复性的皮肤质量检测，包括测定细胞群的纯度，以及一些潜在的分子变化。

1.2拉曼光谱诊断皮肤恶性肿瘤：

近年来，皮肤恶性肿瘤的发病率逐年上升，在美国皮肤癌最常见，每年估计350万例非黑素瘤皮肤癌和70000例恶性黑素瘤，而在中国，这一比例也在不断上升中。目前对于区分正常组织和皮肤肿瘤组织的技术具有破坏性且敏感性和特异性不高，而拉曼光谱则为皮肤肿瘤的非侵入性鉴定以及动态监测提供了方法。

1.2.1拉曼光谱用于皮肤黑素瘤：

拉曼光谱与激光共聚焦成像相结合可避免很多上述局限性，提供一种高分辨率，非侵入性的细胞结构分析，并可对活组织和细胞进行实时形态监测。共聚焦拉曼光谱可用于鉴定黑素细胞和其相对应的黑素瘤细胞之间的区别。学者们发现，这两种细胞形态上很难发现差异，而共聚焦拉曼光谱则发现在代表胶原、磷脂、蛋白、脂质以及酰胺Ⅰ区域的黑素细胞信号强度要高于黑素瘤细胞，同时黑素瘤细胞在代表色氨酸的区域信号强度高于黑素细胞，这一发现有利于早期发现皮肤黑素瘤。

同时，有研究发现，拉曼光谱可用于鉴别黑素瘤细胞的死亡方式。学者们通过药物分别诱导黑素瘤细胞凋亡，自我吞噬和坏死，并用拉曼观察细胞死亡时分子振动的差异，由此鉴别3种死亡方式，同时用拉曼光谱了解黑素瘤细胞在不同抗癌药物剂量的死亡率，可指导皮肤黑素肿瘤的药物治疗。在机制研究方面，有人利用拉曼光谱研究了3种不同剂量（130、1505、15052JM2）的紫外线照射黑素瘤细胞后的细胞核变化，发现脂质积累是侵袭性癌细胞的特点之一，并参与了快速细胞增殖的膜增殖，为皮肤黑素瘤的治疗方向提供了新思路1.2.2拉曼光谱用于非黑素瘤皮肤癌诊断：

在非黑素瘤皮肤癌的研究中，共聚焦拉曼光谱依然起到了重要作用，其被应用到鉴别人永生化表皮细胞与鳞状细胞癌细胞之间的区别，人永生化表皮细胞在代表了酪氨酸、磷脂、蛋白，酰胺Ⅰ和脂质波谱处的峰强度均高于鳞状细胞癌细胞，而鳞状细胞癌细胞在色氨酸处波峰强度高于人永生化表皮细胞。

Lim等利用拉曼光谱区分黑素瘤、非黑素瘤性色素性皮损、基底细胞癌、光线性角化病和鳞状细胞癌，将分类结果与病变的组织病理进行比较，发现敏感性/特异性均在90％/85％以上，为快速准确区分黑素瘤和非黑素瘤皮肤癌提供检测手段。Silveira等利用拉曼光谱和多元变量分析了基底细胞癌、鳞状细胞癌、光线性角化病和正常皮肤组织的区别，并发现鳞状细胞癌与光线性角化病的谱系相似，暗示组分相似，这一发现为后续研究奠定了基础。

1.3拉曼光谱用于其他皮肤病的诊断：

已有学者利用近红外傅立叶变换拉曼光谱分析了正常皮肤和银屑病角质层的蛋白质、水和脂类的差异，发现银屑病角质层的结晶脂质结构被破坏，主要的光谱差异出现在蛋白质的分子结构，与正常皮肤比较，银屑病在光谱酰胺Ⅰ带的峰值位置波数更高，而二者的含水量差异无统计学意义。早期有研究证明，丝聚蛋白基因突变有助于特应性皮炎的分型，有学者用拉曼光谱评价12例婴儿出生时皮肤中丝聚蛋白的存在，监测12例婴儿1年，发现丝聚蛋白含量较低者易发展成为特应性皮炎，因此，拉曼光谱可作为该病无创性早期检测手段，并定量检测可能突变的丝聚蛋白基因。

1.4拉曼光谱用于指导皮肤病治疗：

拉曼光谱还应用于研究药物经皮吸收的程度，如在人皮肤中维生素A衍生物的经皮灌注研究，在表皮部位，维生素A衍生物具有特异的拉曼峰值。Bonnist等利用拉曼探针技术来评价使用吡啶硫酮锌洗发水治疗后的头皮脱屑状况，评价因子包括天然保湿因子、脂质、乳酸、尿素和水，发现头皮屑角质层比非头皮屑头皮含较低的天然保湿因子、乳酸和水，而这些因子在一次治疗后便有所回升，这为疗效提供了精确评价。HIV感染、特异性皮炎、皮肤老化中均会出现皮肤干燥，Mischo等利用拉曼光谱探讨3种干燥皮肤的差异性，对于老年和HIV患者，发现其表皮内的脂质减少，特应性皮炎患者和他们的健康对照组的脂质和水的值是相似的，为进一步个体化治疗提供依据。此外拉曼光谱在光老化皮肤、大气湿度对皮肤角质层的影响、天然保湿因子在皮肤中的定位的研究中也发挥相应的鉴定作用。

2.结语

拉曼光谱凭借非侵入性、快速、灵敏度高等特点，已从理论向临床实现转变。从生物大分子到病理组织、细胞，直至活体，拉曼技术在疾病的早期诊断、监测、治疗指导方面的应用也已得到肯定。目前学者们为了提高拉曼光谱检测的灵敏性，开发了一些延伸技术，如拉曼探针、拉曼的3D共聚焦显象、纳米棒技术等。为了更加准确地进行检测，获取更深层的信息，远红外激光进一步代替了紫外激光和可见光，但如何结合多种成像技术，同时实现磁性、荧光、MRI等多模态成像，获得有关疾病的多维信息，仍需研究者们进一步探索。