核酸适配子在胶质瘤中的研究进展

　　胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤。由于传统的胶质瘤治疗方法受到放化疗抗性、血脑屏障对药物不通透等多种因素的影响，疗效受到明显的限制，因此对胶质瘤靶向治疗的研究越来越受到人们的重视[1]。核酸适配子可以特异性结合靶向物质，相对分子质量小，适合穿过血脑屏障作用于中枢神经系统肿瘤。与抗体相比，适配子表现出多种优点：①相对分子质量小，细胞和组织渗透性强，结构稳定；②无免疫原性和毒性，可作为疾病诊断和治疗的工具；③靶分子广泛，结合靶分子的亲和力高且特异性强；④易于在体外合成和修饰，可短期内批量生产等[2]。由于其独特的特性，适配子有望作为药物运输载体、分子探针或抑制剂等在胶质瘤的诊断和治疗中发挥作用。

　　1、适配子概述

　　核酸的主要功能是携带遗传信息，一些单链核酸分子具有执行各种细胞功能的能力。1990年有研究者报道了应用指数富集配体系统进化技术(syste-maticevolutionofligandbyexponentialenrichment，SELEX)筛选到能与噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料特异性结合的RNA片段，并命名为"适配子"或"适体"。核酸适配子由单链寡核苷酸(DNA或RNA)组成，能以高亲合力和高特异性与靶标结合，并调节靶分子或靶细胞的活性。研究证明适配子可用于多种疾病的诊断和治疗，具有运载药物等功能。

　　SELEX是一种能获取与靶分子高选择、高亲和力结合的寡核苷酸的筛选技术。大多数适配子是通过SELEX从化学随机合成的寡核苷酸文库中筛选得到[3]。SELEX能获取非常广泛的靶分子，包括蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、组织、细胞、细菌等，其中蛋白质类靶分子最多。近年来传统的SELEX经历了多次改进，产生了诸如细胞-SELEX(Cell-SELEX)、组织-SELEX等技术，对促进SELEX的发展具有重要意义[4]。

　　随着人们对适配子功能和应用研究的深入，适配子已成为在疾病诊断及治疗方面一个重要的研究手段。近年来适配子也越来越多地应用于胶质瘤的诊断与治疗中[5]。

　　2、适配子在胶质瘤研究中的应用

　　适配子对胶质瘤的诊断与治疗起重要作用：①识别特异的生物标志物；②干扰肿瘤相关靶标分子的活动；③成为显像剂；④发展新型体外诊断和体内成像模式[6]。

　　2.1以受体酪氨酸激酶为靶标的适配子

　　受体酪氨酸激酶在胶质瘤细胞的增殖、分化和存活中占有重要地位，所以靶向受体酪氨酸激酶的适配子可用于胶质瘤的靶向治疗和诊断。

　　Cerchia等[7]以胶质瘤细胞U87MG为靶标筛选出一个适配子(GL21.T)可干扰信号调节蛋白激酶磷酸化，抑制肿瘤细胞增殖。GL21.T适配子的主要靶标是受体酪氨酸激酶Axl，Axl参与胶质瘤的侵袭和扩散，适配子还可以靶向转运微小RNA。GL21.T适配子与let-7g微小RNA结合可以选择性进入Axl表达的肿瘤细胞，在体内外可沉默let-7g的靶标[8]。

　　胶质瘤患者的共同特性是人表皮生长因子受体(EGFR)的表达增高和突变。EGFR编码的蛋白质属Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体，在细胞膜的信号传导中起重要作用，并在多种人类恶性肿瘤中高表达。现已发现EGFR胞外区突变体有多种突变类型，其中最常见的突变是Ⅲ型突变体——EGFRvⅢ。EGFRvⅢ的突变基因产物是一个截短的EGFR，由于缺乏与配体结合的胞外区及羧基末端酪氨酸自磷酸化部位，而导致EGFR不受配体结合的调控，可持续产生相当于EGF的信号而被激活和进行信号转导，增强肿瘤细胞的增殖及侵袭性。EGFRvⅢ在正常细胞中不表达，仅存在于恶性肿瘤细胞，并且与肿瘤的侵袭性和致瘤性相关，是一个很重要的肿瘤治疗靶标[9]。

　　许多研究者一直致力于寻找EGFR的抑制剂来作为胶质瘤治疗的备选药物。近年来已经得到一些能与EGFR和EGFRvⅢ结合的适配子，并且还能够抑制EGFR或EGFRvⅢ的活性。例如选取针对EGFR筛选的RNA适配子，没有修饰的情况下可以作为识别分子特异性地向EGFR阳性的肿瘤细胞运送胶体金纳米粒子[10]，或者用表面固定化的形式来捕获表达EGFR的神经胶质瘤细胞[11]。为了得到能够在体内应用的小分子药物，研究者进一步筛选能阻止在EGF依赖性受体自磷酸化的适配子[12]。一些以EGFR为靶标的适配子能够抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移能力，并可分离和检测肿瘤细胞，在实验室芯片设备中应用广泛[13]。

　　正电子发射断层扫描(PET)和单光子发射计算机化断层显像(SPECT)在肿瘤的影像诊断中具有敏感性高的特点，在临床应用中越来越普遍。用EGFR及其突变体的适配子作为分子探针的肿瘤成像技术引起了许多研究人员浓厚的兴趣。U87-EGFRvⅢ是过量稳定表达EGFRvⅢ蛋白的U87MG细胞。Wu等[14]曾利用Cell-SELEX筛选了针对U87-EGFRvⅢ细胞特异性结合的DNA适配子，将筛选得到的适配子U2与188-铼(188Re)结合后用于肿瘤成像研究。首先将裸鼠皮下种植U87-EGFRvⅢ细胞悬浮液建立荷瘤裸鼠动物模型，再将188Re标记的适配子通过尾静脉注射进入裸鼠，SPECT分析发现放射标记的适配子大量聚集在裸鼠的肿瘤生长部位，可为适配子的胶质瘤显像和靶向治疗提供研究基础。适配子还可运载小干扰RNA进入细胞，Zhang等[15]将针对U87-EGFRvⅢ细胞的适配子运载c-Met小干扰RNA进入胶质瘤细胞，抑制c-Met基因的表达，从而抑制胶质瘤细胞的生长和增殖。

　　血小板衍生生长因子受体(platelet-derivedgrowthfactorreceptor，PDGFR)是酪氨酸蛋白激酶家族成员，能够促进细胞的趋化、分裂与增殖，在机体生长发育、创伤修复等生理过程中起重要作用。血小板衍生生长因子及PDGFR作为血管生成因子，与肿瘤的发生发展密切相关，近年来研究认为，血管生成在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中起重要作用[16]。Camorani等[17]用Cell-SELEX的方法获得了PDGFR-β的适配子并命名为Gint4.T(解离常数Kd值为9.6nmol/L)。Gint4.T能够特异性地结合蛋白质胞外区，且能够快速准确地进入肿瘤细胞，并对PDGFR-β的配体依赖的受体活性和下游信号通路都具有强烈的抑制作用，因此Gint4.T具有能够携带药物进入靶标细胞的能力，具有潜在药用价值。Camorani等[18]的研究发现，针对EGFR和EGFRvⅢ的适配子CL4与Gint4.T协同作用可很好地抑制胶质瘤细胞的增殖。

　　2.2以其他物质为靶标的适配子

　　核仁素在胶质瘤等肿瘤中高表达。AS1411是一个富含鸟苷酸的26个核苷酸，针对核仁素、结构稳定的适配子。AS1411与造影剂、荧光和放射性核素等可同时结合，在移植C6胶质瘤模型上可进行MRI、荧光显影和放射显影等多态显影[19]。Gao等[20]将靶向胶质瘤的AS1411与负载多西他赛的纳米粒子结合，同时连接含12个氨基酸残基的穿膜肽来协助穿透血脑屏障。构建的纳米粒子可靶向血脑屏障的内皮细胞和胶质瘤细胞，并可穿透血脑屏障，在胶质瘤荷瘤鼠的脑内肿瘤组织分布广泛，大大延长了荷瘤鼠的生存期。

　　Kim等[21]报道了用胶质瘤干细胞作为靶细胞的适配子，筛选过程中利用非肿瘤干细胞进行多次反向筛选，得到能够特异性结合胶质瘤起始干细胞的DNA适配子，Kd值在nmol/L水平。由于筛选得到的适配子可以结合胶质瘤干细胞，有望进一步发展为治疗药物或者作为纳米粒子成像试剂。

　　3、结语

　　随着组织切片SELEX、Cell-SELEX等多种技术和方法研究的相对深入，核酸适配子在胶质瘤的治疗和诊断方面的应用前景也将更加广泛。核酸适配子作为目前已用于化学制药的核酸分子之一，具有很多优越性，对于发病机制的基础科学研究和疾病诊断也有显著的优势。虽然适配子应用于胶质瘤诊断与治疗领域研究时间相对较短，特别是用于体内成像诊断和治疗方面还存在一些问题，但随着其优点及其相关研究逐渐的深入，意味着适配子在胶质瘤研究中将具有更广阔的临床应用前景。