抑制AKT/mTOR通路可以增强索拉非尼在甲状腺癌中的作用

　　抑制AKT/mTOR通路可以增强索拉非尼在甲状腺癌中的作用

　　分化型甲状腺癌（DTC）占所有甲状腺肿瘤的95%左右。放射性碘治疗作为其重要治疗措施，目前在临床上应用广泛，但是在发生转移的情况下，超过半数的患者会发展成为放射性碘难治性DTC。索拉非尼是一种多激酶抑制剂，已被批准用于治疗放射性碘难治的进展期DTC。然而，此类患者的无进展生存期（PFS）仍然较短，且多数患者最终会出现耐药。因此，探索新的治疗方法就显得尤为重要。

　　DTC发生与RAS基因突变相关：RAS基因突变会激活MAPK通路及PI3K/AKT/mTOR通路，并且在DTC中可能会优先激活PI3K/AKT/mTOR通路。这两种通路激活都会导致甲状腺癌恶性程度增高，而且会导致患者对抗肿瘤治疗耐药。已有临床研究证实，AKT磷酸化水平更低的患者对索拉非尼的应答率更高，提示索拉非尼治疗的预后与PI3K/AKT/mTOR通路密切相关。然而，其中的关系和具体机制尚不明确。

　　因此，来自浙江省肿瘤医院的研究团队通过设计细胞实验对索拉非尼与PI3K/AKT/mTOR通路之间的关系及可能机制展开了探索，以期为DTC的治疗提供新的思路。

　　实验设计

　　选取细胞系为人甲状腺癌细胞系8505C和FTC133，用不同浓度索拉非尼作用不同时间，同时应用siRNA干扰技术及抑制剂BEZ235（PI3K和mTOR共同的抑制剂）来抑制AKT通路，观察各组合效果。

　　干扰效率用AKT转录（mRNA水平，通过qRT-PCR检测）及蛋白翻译（磷酸化的AKT、p70s6k，用westernblot检测）水平来验证。p70s6k为mTOR重要下游分子。通路中重要分子（AKT、p70s6k或ERK）的磷酸化水平代表通路激活情况，本研究中，磷酸化水平越高代表激活越明显。

　　用CCK8试剂盒来检测细胞增殖情况和存活率，用膜联蛋白v（Annexin-V）和碘化丙啶染色，再用流式细胞仪来检测细胞凋亡。

　　实验结果

　　1索拉非尼可以有效抑制甲状腺癌细胞增殖，促进甲状腺癌细胞凋亡

　　在8505C和FTC133细胞系中用不同浓度的索拉非尼作用不同时间，可以发现，在剂量高于5uM时，索拉非尼可以有效抑制甲状腺癌细胞增殖，这种抑制作用呈现出时间及剂量依赖趋势。同时，随着索拉非尼剂量增加，作用72小时后8505C和FTC133细胞的凋亡比例均上升，在10uM时分别高达22.9%和56.7%。

　　2索拉非尼可以抑制MAPK及AKT/mTOR通路

　　在8505C和FTC133细胞系中分别用2.5、5和10uM索拉非尼作用24小时，ERK（MAPK通路中重要分子）表达水平无明显变化，但是磷酸化的ERK在10uM条件下与对照组相比显著下降。类似地，用10uM索拉非尼作用24小时，可以显著抑制AKT和其重要下游分子p70s6k的磷酸化。

　　3抑制AKT通路可以促进甲状腺癌细胞凋亡，同时有助于索拉非尼发挥作用

　　研究者通过siRNA干扰技术，使得AKT转录（mRNA水平）显著下降，磷酸化的AKT和p70s6k表达水平也显著下降。如图中所示，AKT-siRNA2的干扰最为有效。在此基础上加入索拉非尼，可以更加有效地降低这两种蛋白的磷酸化水平。

　　此外，通过检测细胞存活率及凋亡情况，可以发现在两种细胞系中，抑制AKT通路同时应用索拉非尼可以显著促进细胞凋亡，降低细胞存活率，其效果比单用索拉非尼或单纯抑制AKT通路更胜一筹。

　　4索拉非尼联合应用BEZ235可以显著提高抗甲状腺癌治疗效果

　　BEZ235作为一种PI3K和mTOR抑制剂，可以有效抑制AKT通路。并且，实验结果证实，BEZ235与索拉非尼合用可以显著促进两种甲状腺癌细胞凋亡，疗效显著高于单用BEZ235和单用索拉非尼。