论著|多灶性甲状腺乳头状癌克隆起源分析

　　论著|多灶性甲状腺乳头状癌克隆起源分析

　　目的探讨多灶性甲状腺乳头状癌（MPTC）的生物学特性及起源。

　　方法回顾性分析2007年1月至2013年7月间美国匹兹堡大学医学中心收治的1510例甲状腺乳头状癌病人的临床资料，采用7基因面板测序对甲状腺癌样本进行分子学检测，比较突变相同与否的MPTC病人的临床和病理学特征。

　　结果776（51.4%）例为MPTC病人，且其与单灶性甲状腺乳头状癌（SPTC）病人相比，具有更高的恶性程度。MPTC病人中检测到突变相同病人（SAME）78例（41%），突变不同病人（DIFF）113例（59%）。SAME组病人中央区淋巴结转移发生率和中央区淋巴结转移百分数均显著高于DIFF组（P＜0.05）。

　　结论41%的MPTC病人具有相同的克隆起源，且其可能具有更高的恶性程度，强烈推荐行预防性中央区淋巴结清扫。

　　甲状腺癌是最常见的头颈部内分泌恶性肿瘤［1］。多灶性甲状腺乳头状癌（multifocalpapillarythyroidcarcinoma，MPTC）是指甲状腺内同时存在两个及两个以上的乳头状癌病灶。因其具有比单发病灶较高的发病率和恶性程度，使MPTC日益受到重视［2］。但是目前MPTC的癌灶究竟是具有独立的克隆起源还是来源于腺内转移具有相同的克隆起源一直具有争议。

　　本文回顾性分析了2007年1月至2013年7月间手术的甲状腺乳头状癌（papillarythyroidcarcinoma，PTC）病人的临床资料和组织学特点及分子学检测状态，探讨MPTC病人的生物学特性和起源，为MPTC的诊疗提供一定的理论依据。

　　资料与方法

　　1.1一般资料

　　回顾性分析2007年1月至2013年7月间美国匹兹堡大学医学中心收治的1510例PTC病人资料。纳入标准为：

　　（1）PTC病人。

　　（2）接受手术治疗。

　　（3）术后病理学检查确诊为PTC。

　　（4）自愿签署知情同意书。手术方式有甲状腺全切除和甲状腺侧叶切除加峡部切除两种术式。研究已被匹兹堡大学医学中心伦理委员会批准通过。

　　1.2突变分析

　　样本来自手术切除的甲状腺癌组织和FNA样本的快速冷冻组织和福尔马林固定的石蜡包埋组织。使用磁性玻璃颗粒试剂盒（Roche）分离总核酸。使用NanoDrop1000分光光度计（ThermoScienificific，Wilmington，DE）评估分离的DNA和RNA的量。

　　使用实时LightCyclerPCR和荧光解链曲线分析，检测组织标本DNA的BRAFV600E和K601E，NRAS密码子61，HRAS密码子61，KRAS密码子12和13点突变。通过RT-PCR设计引物与相应融合点在侧翼相接，检测组织标本RNA的RET/PTC1，RET/PTC3和PAX8/PPARG重排［3］。所有突变阳性的标本使用ABI3100（AppliedBiosystems，FosterCity，CA）上的BigDyeTerminator试剂盒进行测序。

　　1.3术后随访

　　采用信函和电话方式对所有PTC病人的复发和存活情况进行随访，随访截点为末次随访。随访截至2014-11-20。平均随访时间33.5个月。

　　1.4统计学处理

　　采用SPSS22.0软件进行统计学分析。独立样本t检验被用于比较连续变量的均数，结果用均数±标准差表示。对于分类变量，使用χ2检验或Fisher’s精确分析比较各组间构成比差异，用优势比（OR）评估相对危险度并计算95%CI。P＜0.05为差异有统计学意义。

　　结果

　　2.1PTC病人一般资料

　　2007年1月至2013年7月间收治并行甲状腺手术治疗的PTC病人共1510例，其中女性1167例，男性343例，男女比率1∶3.4。PTC病人手术年龄4.3~92.5岁，平均年龄（49.2±15.76）岁。随访过程中，44例病人死亡，其中29例有明确的死亡原因，死于甲状腺癌的病人共8例，占PTC病人总例数的0.5%。在1510例PTC病人中，776例（51.4%）为MPTC病人，734例（48.6%）为单灶性甲状腺乳头状癌（solitarypapillarythyroidcarcinoma，SPTC）病人。

　　2.2MPTC组与SPTC组的临床病理学特征比较

　　1510例PTC病人中，年龄、男性病人例数、颈部淋巴结转移、甲状腺癌腺外侵犯和基因突变方面，MPTC组病人均显著高于SPTC组病人，而肿瘤最大直径显著小于单灶组（P＜0.05），两组在合并桥本甲状腺炎和远处转移发生率方面比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

　　2.3MPTC病人分子学检测结果

　　在776例MPTC病人中，有680例病人进行了分子学检测，553例（81.3％）病人检测有基因突变或重排，其中有191例病人进行了多病灶（≥2个病灶）分子学检测，将这191例病人纳入了下一步分析，并根据多病灶分子学检测结果是否相同将其分为两组：突变相同组（SAME）即所有受检癌灶具有相同的基因突变结果，突变不同组（DIFF）即为至少两个受检癌灶具有不同的基因突变结果。其中SAME组78例（41%），DIFF组113例（59%）。127例（66.5%）病人至少一个癌灶带有BRAFV600E突变。

　　2.4MPTC病人SAME组与DIFF组临床和组织病理学资料比较

　　SAME组与DIFF组在病人的年龄、性别、BRAFV600E阳性突变、双侧MPTC、甲状腺外侵袭、中央区淋巴结清扫（centralcompartmentlymphnodedissection，CLND）、侧方淋巴结转移、桥本甲状腺炎、远处转移和复发的发生率等方面相比较差异均无统计学意义（P＞0.05），两组最大癌灶直径比较差异也无统计学意义（P＞0.05），见表2。在136例行CLND的病人中，SAME组有31例病人检测到中央区淋巴结转移（centrallymphnodemetastasis，CLNM），DIFF组有24例病人检测到CLNM，SAME组病人中CLNM率显著高于DIFF组（P=0.008），SAME组病人平均35.6%的受检中央区淋巴结出现了转移，DIFF组平均16.0%的受检中央区淋巴结出现转移，SAME组病人CLNM百分数也显著高于DIFF组（P=0.010），见表3。

　　比较分析BRAFV600E突变阳性病人中两组CLNM率，其中SAME组中28例出现了CLNM，DIFF组中20例出现了CLNM，SAME组依旧比DIFF组具有更高的CLNM率，差异具有统计学意义（P=0.004），见表4。

　　讨论

　　多病灶是PTC的临床特征之一，发生率为18%～87％［3］，不同研究中MPTC发病率不同可能是由于种族、地理或环境因素等差异所引起，当然检查方法和系统切片的不同处理也可能产生重要影响，本组MPTC为51.4%。多项研究表明，MPTC与颈部淋巴结和远处转移，周围组织侵犯及初次治疗后原病灶残留和原位复发风险升高相关［3］。根据笔者的研究发现，在男性病人患病数、颈部淋巴结转移发生率、甲状腺癌腺外侵犯和基因突变方面MPTC病人均显著高于SPTC病人。根据这些结果，对术前诊断为MPTC的病例笔者推荐行甲状腺全切除术。

　　本研究中，笔者对MPTC病人进行了4种常见的分子标记物（BRAF、RAS、RET/PTC和PAX8/PPARγ）检测，41％的MPTC癌灶具有相同的基因突变或重排，揭示了MPTC的单克隆起源和多克隆起源均可存在这一现象及单克隆起源率。在SAME和DIFF组中，BRAFV600E是最常见的突变。在进行分子研究之前，多数研究认为这些MPTC是由恶性克隆的淋巴管内扩散引起［4］。

　　近年来，随着分子生物学的飞速发展［4-7］，多项研究通过分析X染色体失活、丢失杂合子标记、检测BRAF，NRAS，HRAS和KRAS基因点突变和RET/PTC基因重排，并分析癌灶的组织病理学特征来探讨关于MPTC的起源问题。分子学检测手段的应用，揭示了MPTC多起源的可能。但迄今为止，在MPTC临床特点和起源问题上，尚无权威定论。而对于起源相同及不同的病例的进一步探索对MPTC的预后和治疗就有重要意义。因为单个肿瘤的细胞内转移表明肿瘤具有侵略性，因而可能需要相应的侵袭性治疗。Shattuck等［4］通过研究MPTC癌灶X染色体的失活情况，发现失活形式相同与不同的病人例数相同，均为5例，然而对于剩余5例X染色体失活形式相同的病人癌灶，并不足以证明它们一定是单克隆起源，因为这些病灶可能恰好表现出相同的X染色体失活，但却拥有不同的克隆起源，有一定偶然性。

　　近年来也有不少关于MPTC癌灶的单基因突变研究，如BRAF和RET/PTC［2，8］，但是由于PTC中BRAF突变十分常见，因而对于同时具有BRAF基因突变的病灶也不能完全说明其为同一克隆起源；另一方面，在这些MPTC癌灶的单基因突变研究中，研究者均将具有多个BRAF突变阴性的MPTC病人纳入研究并归入了突变相同组，而这些病人可能具有其他突变形式，因此这可能导致研究者获得较高的起源相同率。此外，在甲状腺肿瘤演化过程中可以发生不同的RET/PTC重排，因此具有不同RET/PTC重排的病灶，也有可能具有相同的克隆起源［8］。最近，有国内外学者开始对MPTC病人进行多基因测序［8-9］，并鉴定出了3种不同类型的克隆进化模式：独立起源、腺内转移和混合传播，但可能由于有限的病例数和不同的病人，其结果尚无统一定论。

　　此外，目前关于MPTC克隆起源对病人临床影响的研究有限［2］，笔者发现，在MPTC病人中，具有相同突变的病人，其颈部CLNM的风险为具有不同突变病人的2.6倍，可能表现出进展更高更具侵略性的疾病模式。多数研究表明BRAF基因突变和癌灶的侵袭性及临床病理特征之间相关联，如甲状腺癌腺外侵犯、淋巴结转移、晚期TNM分期、复发或持续性疾病［10］、肿瘤大小、多灶性。因此，笔者分析了MPTC病人中SAME和DIFF组之间BRAF阳性的差异，结果表明，SAME和DIFF组的BRAFV600E阳性率差异无统计学意义。因此，SAME和DIFF组中CLNM的差异可能不是由BRAFV600E突变的分布引起的。笔者进一步分析了至少具有一个癌灶为BRAFV600E突变阳性的病人，具有相同突变的病人依旧具有更高的CLNM风险。目前对于MPTC，当触诊和影像学检查未怀疑转移性疾病时，是否应进行预防性CLND，尚存在争议［11］。笔者的研究结果证实，在SAME和DIFF组，都有较高的CLNM发生率，分别为53.4%和30.8%，但是SAME组的CLNM显著高于DIFF组。因此，当MPTC病人存在两个或两个以上地基因突变或重排时，不论突变相同与否，即使术前颈部CLNM检查阴性的病人，都可能有必要行预防性的CLND。

　　笔者的研究仍有一定的局限性，由于只进行了7个基因突变或重排的检查，那些被鉴定为突变阴性的肿瘤可能具有其他基因突变。因此，可能需要使用下一代基因测序分析做进一步研究。

　　存在约41%的MPTC病人的多发病灶具有相同的基因突变，说明其可能具有相同的克隆起源，且其可能具有更高的CLNM风险，即使术前检查CLNM呈阴性者,仍建议行预防性CLND。