细胞自噬在酒精性股骨头坏死中的作用

股骨头坏死（osteonecrosisofthefemoralhead，ONFH）是以骨的活性成分死亡为主要改变的病理过程【1-5】。该病主要分为创伤性ONFH和非创伤性ONFH两大类，前者主要因髋部外伤引起，而后者的致病因素以激素或酒精最为常见。目前对于酒精性ONFH的确切发病机制尚不十分清楚。自噬是维持细胞正常功能的一个重要机制，其调控异常可导致各类疾病的发生【6】。目前已有研究证实细胞自噬是软骨对自身的一种重要保护机制，软骨细胞的自噬水平随着机体衰老的进程而逐渐降低，因而体内细胞自噬水平降低被认为是引起关节软骨退变的重要原因之一【7-10】。但在酒精性ONFH进程中是否也存在细胞自噬水平的改变，以及细胞自噬是否在ONFH的进展过程中也发挥着重要作用，目前尚无定论。本研究主要探讨细胞自噬在酒精性ONFH中的作用及其机制，以期为防治ONFH提供新的思路和依据。

材料与仪器

1.实验动物

1月龄健康雄性SPF级C57小鼠15只，体质量20～25ｇ，由温州医科大学茶山动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK（浙）2016-0006。实验方案通过医学动物实验伦理委员会批准。

２.实验试剂与仪器

MC3T3-E1细胞（浙江美谷生物有限公司），雷帕霉素（美国Sigma公司），CCK8细胞活性检测试剂盒、RIPA细胞裂解液、BCA蛋白含量测定试剂、SDA－PAGE凝胶配制试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），α－MEM液体培养基［赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司］，苏木素－伊红（hematoxylinandeosin，HE）染色试剂盒（北京索来宝公司），哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）抗体、微管相关蛋白１轻链３（microtubule-associatedprotein１lightchain3,LC3）Ｂ抗体、Beclin-1抗体、β－actin抗体（美国CellsignalTechnology公司），ECL发光液（美国Invitrogen公司），聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜、超纯水净化系统（美国Millipore公司）。

方法

1.动物分组、造模和取材

适应性喂养１周后将15只1月龄SPF级C57小鼠随机分为空白对照组、酒精组、雷帕霉素－酒精组，每组５只。将雷帕霉素溶于酒精中制成浓度为20mg·mL-1溶液，过滤消毒后，重悬（0.25％聚乙二醇，0.25％吐温８０）成浓度为1mg·mL-1的雷帕霉素溶液。空白对照组喂食饮用水6周，每天腹腔内注射5mg·mL-1不含雷帕霉素的溶剂（酒精过滤消毒后，采用0.25％聚乙二醇、0.25％吐温80配置的用于溶解雷帕霉素的溶剂），连续注射2周；酒精组喂食含30％酒精的饮用水６周，每天腹腔内注射５mg·mL-1不含雷帕霉素的溶剂，连续注射2周；雷帕霉素－酒精组喂食含30％酒精的饮用水6周，每天腹腔内注射５mg·mL-1的雷帕霉素溶液，连续注射2周。干预6周后将小鼠处以安乐死，从其右侧大腿部切开皮肤、皮下组织，剥离股骨周围肌肉，完整获取各组小鼠右侧股骨头，微型CT平扫后将股骨头用10％甲醛固定、用10％乙二胺四乙酸二钠溶液脱钙，石蜡包埋切片。

2.模型鉴定

用微型CT平扫各组小鼠右侧股骨头，观察股骨头组织形态。将切片置于55℃烤箱30min后浸润于二甲苯中10min，更换新的二甲苯后再次浸润10min；用PBS清洗3次，每次５min；用无水乙醇及梯度浓度酒精水化，再次用PBS清洗３次，每次５min；苏木素染色10min，用清水洗去多余的染色液10min；蒸馏水洗涤10ｓ，１％盐酸乙醇褪色分化5s，伊红染色１min左右后用PBS清洗３次，每次５min；再次使用梯度浓度酒精脱水。脱水完成后使用二甲苯透明５min，用中性树胶封片，光学显微镜下观察股骨头组织形态。于高倍镜下任选５个视野，每个视野内计数50个骨陷窝，计算空骨陷窝百分比，以此表示总细胞凋亡率。空骨陷窝百分比＝空骨陷窝数／骨陷窝数×100％。

3.不同浓度酒精干预下MC3T3-E1细胞相对生长率测定

采用CCK8法检测MC3T3-E1细胞相对生长率。在α－MEM培养基中，传代培养MC3T3-E1细胞至第３代后，将其计数稀释后以每孔5×104个细胞的密度接种于96孔板中，细胞贴壁后弃培养液，加入含酒精浓度为０mmol·L-1（对照组）、25mmol·L-1、50mmol·L-1、100mmol·L-1、200mmol·L-1的α-MMEM培养基，孵育24h，孵育时使用封口膜封闭96孔板，防止酒精挥发。处理完成后，再将10μL的CCK8反应液加入到每个孔中，将96孔板用封口膜封闭后置入37℃的培养箱中再孵育１ｈ。将96孔板从培养箱中取出，用酶标仪以450nm波长检测样品吸光度值（OD值），计算MC3T3-E1细胞相对生长率。细胞相对生长率＝（实验组OD值－培养基OD值）/（对照组OD值－培养基OD值）。

4.MC3T3-E1细胞分组

根据预实验所得出的最佳酒精干预浓度（100mmol·L-1）及最佳孵育时间（24ｈ），将培养好的第３代MC3T3-E1细胞随机分为４组，分别以普通α－MEM培养基（正常组）、含100mmol·L-1酒精的α－MEM培养基（含酒精组）、含100mmol·L-1雷帕霉素的α－MEM培养基（含雷帕霉素组）、含100mmol·L-1酒精和100mmol·L-1雷帕霉素的α－MEM培养基（含酒精－雷帕霉素组）培养，均连续培养24h。

5.MC3T3-E1细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、ｍTOR、Beclin-1的蛋白表达检测

采用Westernblot法。在每个面积为16cm2的MC3T3-E1细胞培养皿中加入200μL预冷的RIPA裂解液，同时加入１％的蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟。用细胞刮刀收集细胞,并用移液枪将细胞转移至离心管中，并反复吹打混匀后，于预先准备好的冰上放置20min。在４℃下离心５min（转速12000r·min-1，离心半径8cm），取上清液，得到总蛋白。

BCA法测定蛋白浓度，根据样本总蛋白浓度测定的结果，加入相应体积的总蛋白样品与5倍蛋白质凝胶电泳上样缓冲液，轻轻混合，沸水中煮5min使蛋白变性，制备成蛋白样品，立即插入冰中待用；将样品轻轻加至凝胶孔中，电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至恒压80V，当蛋白至分离胶中时使用120V恒压。当蛋白样本电泳至胶的最下端时结束电泳。采用半干转的方式将蛋白转膜至PVDF膜上，其中LC3B抗体使用直径0.22μｍ的PVDF膜，Beclin-1、mTOR和β-actin使用直径为0.45μｍ的PVDF膜。

转膜完成后用TBST缓冲液洗涤３次，每次10min，将转移膜置于封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭１ｈ；将一抗（LC3B、mTOR、Beclin-1）用封闭液稀释（抗体稀释度均为1:300，内参β－avtin抗体稀释度为1：1000）。将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，注意反应面必须被一抗工作液完全覆盖，４℃下摇床反应过夜。洗净一抗后放入二抗工作液（稀释度为1∶3000）中，室温、避光下在摇床中缓慢摇晃60min，用TBST洗去游离二抗。ECL试剂的Ａ液、Ｂ液等体积混合，制成显影反应液，滴加液体至PVDF膜上直至覆盖整张膜，避光反应2min后曝光拍照。应用ImageLab图像处理软件分析目的蛋白和内参β－actin条带灰度值，计算机自动读取并记录每条条带的灰度值。

２．６数据统计采用SPSS20.0统计软件对所得数

据进行统计学处理，不同浓度酒精干预后MC3T3-E1细胞相对生长率的比较及４组小鼠MC3T3-E1细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值及ｍTOR、Beclin-1蛋白表达的组间整体比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准α＝0.05。

结果

1.股骨头组织形态

①CT扫描结果：空白对照组小鼠股骨头骨小梁大体形态良好，分布均匀，未见软骨下坏死带形成［图１(1)］；酒精组小鼠股骨头软骨下坏死带形成，骨小梁闭塞，髓腔内骨小梁变细、稀疏、断裂，骨皮质增厚［图１(2)］；雷帕霉素－酒精组小鼠股骨头CT影像学表现介于酒精组与空白对照组之间，可见髓腔内部分骨小梁出现断裂萎缩，软骨下骨部分坏死形成［图１(3)］。

②显微镜下观察结果：空白对照组小鼠股骨头骨小梁形态良好，未见空骨陷窝、脂肪细胞及脂质沉积，无组织坏死、纤维化［图２(1)］；酒精组小鼠股骨头骨小梁稀疏、紊乱，脂肪细胞增多，骨细胞内脂质沉积，可见大量空骨陷窝形成，局部组织坏死、纤维化，细胞数目减少［图２(2)］；雷帕霉素－酒精组小鼠股骨头部分骨小梁出现断裂、萎缩，可见少量空骨陷窝形成［图２(3)］。

2.总细胞凋亡率

空白对照组总细胞凋亡率为（6.06±1.93）％，酒精组为（63.9±9.63）％，雷帕霉素－酒精组为（34.0±5.82）％；３组总细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（Ｆ＝192.800，Ｐ＝0.000）；进一步两两比较，酒精组和雷帕霉素－酒精组总细胞凋亡率均大于空白对照组（Ｐ＝0.000，Ｐ＝0.000），酒精组总细胞凋亡率大于雷帕霉素－酒精组（Ｐ＝0.000）。

3.不同浓度酒精干预后MC3T3-E1细胞相对生长率

不同浓度酒精干预２４ｈ后MC3T3-E1细胞相对生长率比较，差异有统计学意义（Ｆ＝106.900，Ｐ＝0.001）。未经酒精干预的MC3T3-E1细胞相对生长率高于浓度为25mmol·Ｌ-1、50mmol·Ｌ-1、100mmol·Ｌ-1、200mmol·Ｌ-1的酒精干预后的MC3T3-E1细胞相对生长率（Ｐ＝0.011，Ｐ＝0.000，Ｐ＝0.000，Ｐ＝0.000）。见表１、。

４.MC3T3-E1细胞中LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的比值及mTOR、Beclin-1蛋白表达

４组小鼠MC3T3-E1细胞中LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的比值比较，组间差异有统计学意义；正常组MC3T3-E1细胞中LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的比值高于含酒精组（Ｐ＝0.000），低于含雷帕霉素组（Ｐ＝0.000），与含酒精－雷帕霉素组比较差异无统计学意义（Ｐ＝0.166）；含酒精组MC3T3-E1细胞中LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的比值低于含雷帕霉素组及含酒精－雷帕霉素组（Ｐ＝0.000，Ｐ＝0.000）；含雷帕霉素组LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的比值高于含酒精－雷帕霉素组（Ｐ＝0.000）。

４组小鼠MC3T3-E1细胞中ｍTOR蛋白表达量比较，组间差异有统计学意义；正常组MC3T3-E1细胞中ｍTOR蛋白表达量低于酒精组（Ｐ＝0.033），高于含雷帕霉素组及含酒精－雷帕霉素组（Ｐ＝0.000，Ｐ＝0.000）；含酒精组MC3T3-E1细胞中ｍＴＯＲ蛋白表达量高于含雷帕霉素组及含酒精－雷帕霉素组（Ｐ＝0.000，Ｐ＝0.000），含雷帕霉素组ｍTOR蛋白表达量低于含酒精－雷帕霉素组（Ｐ＝0.000）。

４组小鼠MC3T3-E1细胞中Beclin-1蛋白表达量比较，组间差异有统计学意义；正常组MC3T3-E1细胞中Beclin-1蛋白表达量高于含酒精组，而与含雷帕霉素组、含酒精－雷帕霉素组比较，组间差异均无统计学意义（Ｐ＝0.077，Ｐ＝0.127）；含酒精组MC3T3-E1细胞中Beclin-1蛋白表达量低于含雷帕霉素组及含酒精－雷帕霉素组（Ｐ＝0.000，Ｐ＝0.000）；含雷帕霉素组MC3T3-E1细胞中Beclin-1蛋白表达量高于含酒精－雷帕霉素组（Ｐ＝0.004）。见图４至图６、表２。

LC3：微管相关蛋白１轻链３；mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

LC3：微管相关蛋白１轻链３

mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

LC3：微管相关蛋白１轻链３；mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

讨论

ONFH属中医学“骨痹”“骨痿”“骨蚀”“历节风”“髋骨痹”等范畴。中医学认为该病由风、寒、湿、热等外邪侵袭人体，痹阻经络，气血运行不畅所致【3】。有研究认为，ONFH的发病本质在于股骨头血供中断或受损，导致骨细胞凋亡【11】。目前对于酒精性ONFH的发病机理存在诸多学说，如骨质疏松、骨内高压、血管内凝血、骨细胞毒素作用、骨细胞凋亡、脂肪代谢紊乱等学说【1-5】，但其确切发病机制尚不十分清楚。现已有研究证实，细胞自噬是软骨自身的一种重要保护机制，而自噬降低被认为是引起关节软骨退变的重要原因之一【7-10】。Zhang等【12】研究发现，在低氧及无血清的情况下间充质干细胞可以通过提高自噬水平来促进自身存活。另外，Xia等【13】通过体外骨细胞培养发现，在激素引起骨细胞变性、凋亡的过程中，自噬也起到了非常重要的保护作用，抑制自噬后骨细胞的死亡数明显增加。因而我们推测细胞自噬在酒精性ONFH的病变过程中也可能发挥着非常重要的作用。

本实验采用浓度为30％的酒精喂食小鼠，构建酒精性ONFH模型。模型建立后将获取的股骨头组织用HE染色，在显微镜下观察股骨头组织形态，结果显示，在酒精干预下，酒精组小鼠股骨头中脂肪细胞增多、骨细胞内脂质沉积，股骨头骨小梁稀疏、紊乱，空骨陷窝计数增多，且多于空白对照组及酒精与雷帕霉素组；从微型CT检查结果看，单纯酒精饲喂后构建的小鼠酒精性ONFH模型中，股骨头软骨下坏死带形成，骨小梁闭塞，髓腔内骨小梁变细、稀疏、断裂，出现骨皮质增厚的现象，但是腹腔内注射雷帕霉素后，股骨头大体形态良好，部分骨小梁出现断裂、萎缩，软骨下坏死带明显少于单纯酒精喂食的小鼠。

在体外实验中，我们通过Westernblot法检测自噬相关蛋白mTOR、Ｂｅｃｌｉｎ１和ＬＣ３在MC3T3-E1细胞中的表达量，结果显示含酒精组MC3T3-E1细胞中LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的比值及Beclin1蛋白含量较其他组均显著降低，而mTOR蛋白表达量较其他组明显升高；含酒精－雷帕霉素组MC3T3-E1细胞中mTOR蛋白表达量低于含酒精组。由此可见，单纯酒精刺激可以引起细胞自噬水平的降低，而雷帕霉素可以与酒精抑制自噬的作用相拮抗。

LC3是公认的细胞自噬标志物，自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-Ⅰ）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-Ⅱ），LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值的大小可估计自噬水平的高低。mTOR复合体和Beclin1复合体是调节细胞自噬的关键分子，它们在自噬的发生过程中发挥了至关重要的作用【14-15】。

目前普遍认为mTOR通过两种机制发挥对细胞自噬的调节作用：

①mTOR介导的信号转导作用于下游效应物，如转录起始因子４E结合蛋白１、核糖体蛋白S6激酶，启动相关基因转录和翻译，从而控制细胞自噬；

②mTOR激酶直接作用于Atg蛋白来调节自噬体的形成【16-17】。当mTOR活性受到抑制时促使细胞自噬发生，当mTOR活性增高时自噬被抑制。Beclin1又称BECN1，它是酵母自噬相关基因ATG6的同系物，也是哺乳动物参与细胞自噬的特异性基因，Beclin1基因主要通过与Ⅲ型磷酯酰肌醇３激酶形成复合体来调节其他ATG蛋白在自噬前体结构中定位，调节自噬活性【18-19】。有研究已证实，通过上调Beclin1在哺乳动物细胞中的表达能够刺激自噬的发生，敲除该基因细胞自噬则不能发生【14、17】。

本研究使用的雷帕霉素是经典的细胞自噬增强剂，自噬的调控途径主要涉及经典的磷酯酰肌醇３激酶／蛋白激酶Ｂ／雷帕霉素靶蛋白信号途径。而雷帕霉素通过抑制mTOR，诱导和促进细胞自噬过程，许多因素对自噬的影响均与mTOR的活性变化有关［２０－２１］。我们在研究中发现用雷帕霉素增强细胞自噬水平后，细胞的凋亡水平以及细胞生长抑制率明显降低，这说明细胞自噬能够一定程度上抑制酒精刺激下的MC3T3-E1细胞的死亡，细胞自噬对成骨细胞（MC3T3-E1）起着一定的保护作用，这将为治疗酒精性ONFH提供新的思路。

本研究结果显示，细胞自噬在酒精性ONFH的病变过程中发挥着非常重要的保护作用。酒精刺激引起的细胞自噬水平的降低可能是引起ONFH的原因之一，其作用机制可能与酒精刺激影响自噬关键调控分子mTOR、Beclin1的表达有关。今后，提高细胞自噬水平可作为预防或治疗酒精性ONFH的重要靶点。