酸性环境对椎间盘退变影响的研究进展

　　椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IVDD)引起的腰痛是最常见的脊柱疾病[1]。有研究统计IVDD引起的腰痛影响着全球约80%的人口[2]，其也是导致20～50岁人群劳动能力受限的主要原因之一[3]。在美国，每年用于治疗腰痛的花费高达5 000亿美元[4]。随着全球人口老龄化的到来，IVDD的发病率越来越高，严重影响人们的工作和日常生活，是一个严峻的社会经济问题[5]。IVDD发生是一个包括多种因素(如衰老、过度负重、外伤、吸烟、糖尿病、遗传因素等)在内的复杂的过程[6]，其退变机制目前仍尚不明确[7]。研究表明，酸性环境对椎间盘退变有着一定影响[8]。椎间盘细胞对于细胞外基质酸性环境的变化非常敏感。在一定的酸性环境中，细胞外基质的合成速率下降，降解速率上升[9]，如果长时间处于这种环境中，椎间盘细胞就会死亡[10]。现就椎间盘细胞如何感知细胞外酸性环境变化从而发生椎间盘退变的相关研究进展综述如下。

　　1．椎间盘组织酸性环境的成因：正常椎间盘组织的pH值范围为7.0～7.2[11]，在严重退变的椎间盘组织中pH值可以下降到6.5，甚至有报道在人类退变椎间盘的手术标本中pH值下降达到5.5[12,13]。椎间盘组织中酸性环境的形成，主要由以下3个方面因素：(1)椎间盘位于两个椎体之间，由髓核、纤维环和终板软骨3部分构成。髓核细胞是类软骨细胞，细胞外基质以蛋白多糖和Ⅱ型胶原为主；纤维环细胞是类成纤维细胞，细胞基质以Ⅰ型胶原为主，含少量的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。椎间盘为人体最大的无血管组织，其能量代谢主要依靠糖酵解[14]，乳酸为糖酵解重要的代谢产物，因此，在正常椎间盘内就存在酸性微环境。在椎间盘退变过程中，随着终板渗透性的降低，葡萄糖和氧的供给减少，代谢产物乳酸堆积，导致椎间盘内组织微环境变得更加恶劣，其pH值进一步下降[15]。(2)组织在合成硫酸化氨基葡聚糖链时，同时会有大量的COO－和SO42－存在于机体中，这就使组织携带了特定的高电位负电荷。这些负电荷能够吸引Na＋、K＋及H＋。因此，软骨样基质中的H＋含量总是会比周围组织高，其pH值也比周围的血清及滑膜液平均低0.5个单位[16]。此外，椎间盘常常处于各种类型的负荷之下，椎间盘中大约有20%～25%的液体会随着负荷不断地挤出和重吸收。当椎间盘中的液体被挤出时，蛋白多糖的浓度随之升高，这必然会增加特定负电荷的密度及H＋的浓度，最终升高了组织的酸性程度[17]。(3)细胞本身的排酸机制，也会对细胞外基质的酸性环境产生影响。细胞外酸性环境是椎间盘基质代谢的重要决定因素，其可能通过细胞内pH值的变化而发挥作用。椎间盘细胞内存在一定数量具有排酸功能的Na＋-H＋交换体。它在排酸的同时也就降低了周围组织的pH值[18]。

　　2．酸性环境对椎间盘基质及细胞的影响；酸性环境对椎间盘基质的合成代谢以及分解代谢都起着重要的作用。在pH值6.9～7.2时，人椎间盘的35S硫酸盐和3H-脯氨酸结合率最大，比pH值7.4时的结合率高40%～50%。在pH值6.8时，结合率急剧下降，并且硫酸盐的下降比例比脯氨酸的下降比例更为明显。在pH值为6.3时，硫酸盐的结合率约为pH值7.4时的20%，这表明酸性环境可导致椎间盘内蛋白多糖合成速率下降，最终导致蛋白多糖含量下降和椎间盘退变[9]。在pH值6.4时，金属蛋白酶组织抑制剂(matrix metalloproteinases hibitors，TIMPs)的含量下降了近90%，然而基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)下降却不明显，这表明酸性环境不能有效地阻止椎间盘细胞分解代谢[11]。在正常pH值条件下，转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)能够显著增加氨基葡聚糖的合成，但随着椎间盘内pH值的下降，TGF-β的刺激氨基葡聚糖合成作用就消失了[19]。Wuertz等[20]研究认为，酸性环境会显著抑制椎间盘内间充质干细胞基质蛋白的基因表达(成熟细胞为3倍，年轻细胞为4倍)，但抑制Ⅰ型胶原基因表达的作用却不明显。同时，酸性环境明显地抑制了间充质干细胞的增殖(成熟细胞及年轻细胞均为2倍)，通过荧光染色发现，酸性环境还会减少椎间盘细胞的数量。酸性环境是影响间充质干细胞生物合成和增殖的关键因素，随着椎间盘的退变，椎间盘中的酸性环境会进一步加剧，这就使椎间盘的内环境变得更加不利于间充质干细胞修复损伤的椎间盘。随着椎间盘内酸化程度的增加，人髓核细胞内白细胞介素(IL)-1β低水平活化与炎性细胞活性降低相一致，这表明酸性刺激并未触发IL-1β介导的炎症[21]。Guehring等[22]研究发现，相对于软骨样成熟髓核细胞，椎间盘中的脊索细胞更易受到pH值的影响。在酸环境中，脊索细胞的糖酵解速率显著增强。

　　3．酸性靶点通道：Ludwig等[23]报道称为质子感知受体(proton-sensing receptor)的卵巢癌G蛋白偶联受体1(ovarian cancer G protein-coupled Receptor 1，OGR1)及G蛋白偶联受体4(GPR4)受体，在学术界引起反响。Murakami和Okajima两个研究小组分别报道了诱导细胞停滞于G2/M期的G蛋白偶联受体(G2A)和T细胞死亡偶联基因8 (TDAG8 )为质子感知受体[24,25]。OGR1、GPR4、G2A及TDAG8 4个质子感知受体统称为OGR1亚家族受体，其中，GPR4和TDAG8对H＋敏感性最强，而OGR1和G2A对H＋敏感性较弱。OGR1亚家族受体在体内分布广泛，介导细胞内多种信号通路的传递作用，并参与肿瘤发生、炎症反应及骨代谢等一系列疾病的病理生理过程[26,27,28]。近来还有研究表明，SD大鼠椎间盘终板软骨细胞表达OGR1，G2A及TDAG8质子感知受体3个亚家族成员，而细胞外酸化(pH6.4)明显升高OGR1的表达，通过介导Ca水平进一步激活Ca敏感的蛋白酶和下游信号Bid、Bad、Caspase-3、PARP和Caspase-3信号通路，导致椎间盘终板软骨细胞凋亡[29]。在一些炎性疾病中，pH值降低可促进OGR1的进一步表达，研究发现在缺氧、低pH值条件下，HIF-1α可与OGR1的启动子相结合，从而对OGR1的激活产生正向调节[30]。G2A与细胞周期、增殖、免疫密切相关。酸性环境下，G2A可以通过G13-Rho信号通路发挥作用[31]。在pH值7.6时，G2A的瞬时表达，可显著活化zif 268启动子和磷酸肌醇(IP)积累，并且随着pH的降低，G2A的表达可进一步增强[24]。在HEK293细胞中，酸性环境可使GPR4和TDAG8过表达，导致SRE-和CRE-驱动启动子的转录激活，这对肿瘤细胞的促进和形成具有重要作用[32]。酸性环境下，TDAG8可增强炎性细胞的活性，缺乏TDAG8可加速相关疾病的退变[33]。

　　Krishtal等[34]在神经元上首次记录到了一种被H＋激活的阳离子电流，推测细胞膜上可能存在质子受体，但一直无法证实。Waldmann等[35]克隆了第一个被酸激活的通道蛋白，将其命名为酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels, ASICs)的亚基，开启了研究的新纪元。ASICs是一类H＋门控非电压敏感离子通道，属于阿米洛利敏感退化/上皮Na＋通道超家族成员[36]。目前为止，已克隆了由4个基因编码的6个ASICs亚基：ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4[37]。其中，ASIC3对H＋的敏感度最高，而ASIC1a与ASIC1b居中，ASIC2a与ASIC2b为最低。ASIC1a、ASIC2a广泛表达于中枢神经系统和外周神经系统；ASIC1b、ASIC2b和ASIC4则以外周神经系统表达为主；ASIC3主要表达于外周伤害感受神经元上感受冷热、疼痛等外周伤害性刺激。最新研究发现，ASICs各亚基在骨、软骨及椎间盘等非神经组织也均有表达并发挥重要生理病理功能[38,39,40]。前期研究发现，ASICs与椎间盘退变有着密切关系[41]。Cuesta等[42]在人正常椎间盘中均检测到ASIC1, ASIC2, ASIC3和ASIC4表达，而人退变椎间盘中，ASIC1, ASIC2, ASIC3和ASIC4表达水平均明显升高。在人正常椎间盘的髓核细胞和纤维环细胞中，最常表达的是ASIC2，随后是ASIC3，ASIC1和ASIC4。而在退变的纤维环细胞中，ASIC1和ASIC4表达显著增加，而在退变髓核细胞中，ASIC1，ASIC2和ASIC3的表达显著增加。细胞外酸性环境，可以导致椎间盘终板软骨细胞蛋白聚糖，Ⅱ型胶原表达降低，而MMP-1，MMP-9和MMP-13表达及活性增加，但ASIC1a siRNA可阻断这些效应，同时其也可阻断P65核水平磷酸化和IκBα胞质水平磷酸化，这表明酸性环境下，ASIC1a通过调节NF-κB转录活性而参与椎间盘终板软骨细胞代谢[43]。椎间盘软骨细胞中的ASIC1a激活还可触发Ca2＋依赖性蛋白酶活性和信号传导，最终导致椎间盘终板软骨细胞的凋亡[44]。还有研究表明，人正常椎间盘中也存在ASIC2和TrkB，并且在退变椎间盘中发现其表达显著增加，这表明ASIC2和TrkB可能参与了椎间盘退变[45]。酸性环境可以引起髓核细胞中ASIC3的表达增加，而阻断ASIC3后，髓核细胞的分解代谢和退变受到抑制[8]。此外，ASIC3还参与椎间盘退变引起的疼痛[46]。

　　瞬时受体电位通道(TRP)是一种非电压依赖性阳离子通道，广泛表达于多种哺乳动物的多种组织中，并参与多种重要的生理功能，包括肌肉收缩、递质释放、细胞增殖、细胞分化、基因转录、细胞凋亡及细胞死亡等[47]。根据其编码氨基酸序列的不同，可将TRP基因超家族分为7个不同的亚家族：TRPC，TRPM，TRPV，TRPA，TRPP，TRPML及TRPN[48]。研究发现，TRP可通过Ca2＋相关的下游通路介导多巴胺神经元细胞死亡，从而导致神经元退行性病变[49]。锌指蛋白ZBTB20可调节TRP通道的表达，ZBTB20的破坏可导致TRPV1、TRPA1、TRPM8的表达以及Ca内流水平显着降低[50]。在TRP家族成员中，TRPV1是一种Ca渗透通道，已被广泛研究并且仅在严重酸中毒pH值低于6.0时被激活[51]。有研究显示，TRPV1可能和椎间盘内的炎症和灼痛有关[52]。TRPV1的激活可增加NaV1.8活性，这对于酸诱导的慢性广泛肌肉疼痛中持续痛觉过敏的形成是至关重要的[53]。胶原诱导关节炎大鼠的初级滑膜细胞中存在TRPV1的表达，在pH为5.5～7.4时，可通过TRPV1介导的Ca内流和ROS的产生诱导细胞死亡。而在类风湿关节炎模型中发现，在pH为6.8～7.4时，细胞外酸化可通过减弱TRPV1的活性来抑制辣椒素诱导的Ca内流，同时可以触发与PLC相关的Ca释放；在pH值6.8时，可产生与PLC活化有关的NF-κB核易位，但辣椒素诱发的大量ROS产生和细胞死亡受到抑制，这些结果表明，中度细胞外酸化可通过调节Ca内流，激活NF-κB核移位和抑制ROS产生来抑制辣椒素诱导的滑膜细胞死亡[54]。牛椎间盘中表达TRPV4，且其表达和肿瘤坏死因子α(TNFα)相关，TRPV4激活后可以增加Ca内流，并可促进椎间盘细胞中白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6的基因表达，最终导致椎间盘退变[55]。

　　IVDD是椎间盘突出的前提和基础。椎间盘退变→纤维环破裂、髓核突出→接触周围脊髓或神经根→周围微环境的改变→腰腿痛，是该类疾病大体的演变过程。IVDD引起的临床症状不仅给患者带来巨大的痛苦，也给家庭和社会带来了沉重的经济负担[56]。酸性环境与椎间盘退变的关系是一个非常复杂的问题，酸性靶点通道的发现，为我们治疗IVDD提供了新的视角，具有潜在的科研价值和临床意义。酸性环境在椎间盘退变中所起的作用正逐渐被人们所认知，椎间盘局部环境的改变加速了其退变的过程，而退变本身又会进一步加剧椎间盘内的酸性环境。如何维持椎间盘内酸性环境的稳定，明确酸性环境在椎间盘退变过程中的具体分子机制以及如何通过调控椎间盘中的酸性环境来达到治疗椎间盘退变，是值得我们进一步研究的新课题。