极低出生体重早产儿尿代谢组学研究

极低出生体重(verylowbirthweight，VLBW)儿是指出生体重低于1500g的新生儿，多数出生胎龄小于33周。不同国家VLBW儿的出生率各不相同，美国约为1.5%，国内流行病学调查结果显示发生率为0.7%[1，2]。前期研究普遍认为胎儿时期的营养状况能够对机体的代谢状态产生永久性的影响，其通过程序性调控机制调节成年期疾病的发生。此外，营养过剩及生后早期的生长过快均可能导致成年期胰岛素抵抗及2型糖尿病等代谢综合征的发生[3，4]。与健康足月儿相比，VLBW早产儿由于其出生胎龄低、体重小及消化系统发育不成熟，导致早期营养普遍摄入不足，是发生神经系统后遗症和发育损害的高危人群。代谢组学能够直观的呈现生物体的代谢图谱，对于全面理解机体在应对疾病和外界刺激所产生的特异性代谢变化具有重要意义[5，6]。因此，采用基于气相-色谱质谱(GC-MS)技术的代谢组学方法对VLBW早产儿和健康足月儿尿代谢产物进行分析，旨在研究VLBW早产儿与健康足月儿在代谢水平的差异，直接有效地评估VLBW早产儿营养状态，进而更有针对性的改善和探索最佳营养方案。

 

一、对象

 

采用前瞻性病例对照研究，选择2014年全年中山大学附属第六医院出生的新生儿为研究对象，根据出生体重和胎龄分为VLBW早产儿组和健康足月儿对照组(简称足月儿组)。参考人民卫生出版社《临床流行病学与循证医学》教材中临床研究样本量估算方法设定样本例数。

 

VLBW早产儿组入选标准：(1)为单胎活产儿(体重1000～<1500g，胎龄28～<37周)，非意外引起的早产，无先天畸形和遗传代谢病，无围生期窒息史，出生后一般情况良好，无需复苏或抢救；(2)母亲既往无严重内、外科疾病史(糖尿病、妊娠期高血压疾病等)，无感染性疾病史，无营养不良病史，无酗酒、吸烟、吸毒及滥用药物史；(3)母亲至少在当地居住1年以上。足月儿组纳入标准：与早产儿在同一医院出生的健康单胎活产的新生儿(体重≥2500g，胎龄>37周)，无出生缺陷和疾病，母亲要求同VLBW早产儿组。

 

剔除标准：(1)家长要求终止研究或提前出院；(2)研究过程中出现严重并发症(如脓毒症、坏死性小肠结肠炎、新生儿呼吸窘迫综合征、严重代谢紊乱等)或死亡。

 

本研究获得中山大学附属第六医院伦理委员会的批准(L2016016)，所有尿液样本的采集均获得新生儿家属的知情同意。

 

二、方法

 

1．尿液标本收集：

 

入选新生儿均于出生后24h内收集尿液2ml，尿液标本储存于－20℃冰箱内，于1周内进行检测。

 

2．样品处理及GC-MS分析条件：

 

按文献[7]的方法进行尿代谢产物分析，检测173种常见代谢产物。GC-MS联用仪(日本电子，Q1000)，色谱条件：不分流进样，进样量1μl，进样口温度260℃，离子源温度200℃，接口温度220℃。程序升温起始温度60℃，保持2min，以17℃/min升至220℃，以15℃/min升至325℃，保持10min。载气为氦气，载气流速1ml/min。质谱条件：电离方式电轰击电离(EI)；电子能量70eV；质谱扫描范围：50～650m/z；扫描方式为全扫描方式。

 

3．数据采集：

 

根据质谱峰的m/z进行定性，因质谱峰强度与其代表的化合物含量成正比，通过测定离子峰的强度，即可进行分析。

 

三、统计学处理

 

采用定量分析软件自动计算出所测样品代谢产物的浓度值，对GC-MS检测到的物质进行t检验，获得差异有统计学意义的物质输入在线分析网站进行代谢通路的富集；利用SIMCA-P12.0数据处理软件进行平均值中心化处理后，采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型对两组尿代谢产物进行模式识别并寻找关键差异代谢物。评价OPLS-DA模型匹配度的3个关键指标(R2X表示X矩阵解释率；R2Y代表Y矩阵解释率，二者共同反映模型稳定性；Q2代表模型预测性，三者各大于0.5表明模型匹配良好，越接近1说明模型的匹配度越高)。根据OPLS-DA模型所有变量S-plot图越偏向两端的物质，其协方差和相关性越大，以此筛选差异代谢物。两组计量资料用&plusmn;s表示，比较用t检验；计数资料比较用χ2检验；P<0.05表示差异有统计学意义。

 

结果

 

1．两组基本资料：

 

根据纳入标准和排除标准共纳入VLBW早产儿组20例，其中男11例、女9例，出生胎龄28～33＋1周，平均(30.1±2.0)周，出生体重1001～1450g，平均(1240±136)g；选择同期出生的健康足月儿20名为对照组，其中男9名、女11名，出生胎龄37～40周，平均(38.7±0.9)周；出生体重2850～3850g，平均(3265±243)g。VLBW早产儿组与足月儿组出生胎龄、出生体重比较差异有统计学意义(t＝－17.970、－32.408，P＝0.000、0.000)，两组性别差异无统计学意义(χ2＝0.400，P＝0.527)。