【综述】杜氏肌营养不良基因治疗研究进展

　　杜氏肌营养不良(Duchennemusculardystrophy，DMD)是一种X连锁隐性遗传病，在活产男婴中的发生率为1/3600～1/6000[1]。患儿常在3～5岁发病，典型的临床症状表现为缓慢进展的肌无力伴腓肠肌假性肥大，12岁左右丧失独立行走能力，20岁左右死于呼吸衰竭或心力衰竭[1，2]。DMD是DMD基因突变导致的抗肌萎缩蛋白功能缺失所致。抗肌萎缩蛋白是肌细胞中的骨架蛋白，相对分子质量为427000，含N－端结构域、中央杆状区、半胱氨酸富集区和C端结构域4个结构域，其中，中央杆状区由24个血影蛋白样重复序列区和4个铰链区构成，占整个蛋白链长度的80%[3，4]。DMD尚无有效治疗手段，临床上多采用糖皮质激素类药物改善疾病症状，但并不能改变疾病的最终结局；成肌细胞移植治疗DMD的研究因成肌细胞迁移能力差、存活率低和免疫排斥反应过强停滞不前；肌源性干细胞治疗DMD的研究也存在分化调控机制不清等问题[5，6]。随着基因治疗的不断发展和基因组编辑技术的不断进步，从疾病发生的根源——DMD基因着手，为疾病的治疗带来了新的可能。

 

　　人类DMD基因定位于Xp21.1区域，是目前已知的人类最大的基因，全长约2.4Mb，包含79个外显子和78个内含子，其cDNA全长约14kb[7，8]。DMD基因突变大致可分为三类：大片段的缺失或重复、微小突变(包括碱基的置换、重复、缺失或插入)和剪切区突变[9]。大部分患者DMD基因突变导致DMD基因中三联体密码的阅读方式改变，扰乱翻译阅读框，临床表型较重，称为DMD；少部分患者DMD基因突变为整码突变，阅读框得以保留，可以表达具有部分功能的截短的抗肌萎缩蛋白，临床症状轻，生存期长，称为贝克肌营养不良(BMD)[10]。DMD常规治疗治愈困难，但致病基因明确，且DMD基因突变形式不同，导致症状不同的DMD和BMD，因此将DMD转变为BMD，即“重病”变“轻病”，是DMD基因治疗的一条新思路。现从基因替代、基因编辑和外显子跳跃三个方面来阐述DMD治疗的研究进展。

 

　　传统意义上的基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，纠正或补偿因基因缺陷引起的疾病，达到治疗目的。为了恢复肌细胞中抗肌萎缩蛋白的表达，将DMD基因全长cDNA导入成肌细胞，使其能够长期、稳定地表达具有完整功能的抗肌萎缩蛋白是DMD基因治疗的最理想选择。

 

　　1991年，Acsadi等[11]将载有DMD基因cDNA的质粒通过肌肉注射的方式注入mdx小鼠体内，在1%～2%的mdx小鼠肌纤维中检测到人抗肌萎缩蛋白的表达，但该方法作用范围较为局限。2004年，Romero等[12]将载有DMD基因cDNA的质粒通过肌肉注射的方式注入9例DMD患者肌肉中，在6例患者的肌纤维中检测到了低水平的抗肌萎缩蛋白表达，未发现免疫排斥。然而，质粒介导的基因替代治疗仅能提供短时间的抗肌萎缩蛋白表达，不适用于DMD的治疗。为了解决这一问题，有研究将剪接酶与质粒结合，将载有DMD基因cDNA的质粒插入mdx小鼠基因组中，提高了抗肌萎缩蛋白的表达时间，但该方法存在插入突变的风险[13]。

 

　　与质粒相比，病毒载体转染率高，更多地应用于基因治疗的研究中。DMD基因全长cDNA长度远超出大多数病毒载体容量，因此利用病毒载体导入截短的、能表达具有部分功能的抗肌萎缩蛋白的DMD基因是基因替代治疗的又一选择。1990年，England等[14]从DMD基因第17～48外显子缺失、临床症状轻微的BMD患者基因组中克隆出长为6.3kb的截短DMD基因，称为mini－dystrophingene，编码的蛋白产物具有抗肌萎缩蛋白的主要功能。2010年，Mendell等将装载mini－dystrophingene的腺相关病毒(AAV)载体注射到6例DMD患者肱二头肌中，在2例受试者肌肉中观察到极少的mini－dystrophin表达，但在所有受试者血液中发现了针对mini－dystrophin抗原表位的T细胞免疫应答，可能是导致实验结果不理想的原因[15]。2000年，Crawford等[16]发现抗肌萎缩蛋白羧基端对于维持蛋白的功能不是必需的，构建了敲除中央杆状区20个血影蛋白样结构和大部分羧基端的截短DMD基因，称为micro－dystrophingene，长度为3.75kb。2013年，Shin等[17]在DMD犬模型中证实AAV载导的micro－dystrophingene能在肌肉中持续、稳定表达具有部分功能的抗肌萎缩蛋白，增加DMD犬的肌肉力量。截短的抗肌萎缩蛋白虽具有部分功能，但对于症状的改善程度特别是心肌功能的改善尚未可知。近年，Lostal等[18]将人抗肌萎缩蛋白cDNA分为3部分，分别由3个AAV载体装载，同时注射到mdx小鼠肌肉中，观察到了完整的人抗肌萎缩蛋白表达，但该方法转导效率过低，尚无法达到治疗的目的。此外，最近有研究发现一种未经修饰的慢病毒载体可装载全长的DMD基因cDNA，经修饰的成肌细胞分化的肌管膜上可检测到抗肌萎缩蛋白的表达[19]。

 

 

　　反义寡核苷酸(AONs)是人工合成的、经化学修饰的小的单链核苷酸，可识别特定的基因序列，改变pre－mRNA的拼接，使特定的外显子在拼接过程中与内含子一起被忽略。利用BMD致病性较轻的原理，通过AONs作用跳过特定外显子序列恢复DMD基因阅读框，表达具有部分功能的截短的抗肌萎缩蛋白，是DMD治疗的又一策略。超过80%的DMD基因突变可以通过跳过1到2个特定的外显子恢复阅读框，约13%的DMD患者可以通过跳过51外显子恢复阅读框[20]。自1996年以来，外显子跳跃技术已经应用于许多鼠和犬的DMD模型中，两种外显子跳跃化合物2′‐氧‐甲基硫代磷酸酯寡核苷酸(2′OMePS)和磷酰吗啉寡核苷酸(PMO)也都已应用于临床试验中。

 

　　2007年，荷兰莱顿大学医学中心与英国GlaxoSmithKline公司和荷兰Prosensa公司(后被美国BioMarin公司收购)合作开发了PRO051(后更名为Drisapersen，一种2′OMePS)，诱导DMD基因表达过程中的51外显子跳跃[21]，该药物在Ⅰ期临床试验的应用中恢复了患者肌纤维中抗肌萎缩蛋白的表达，最高可达正常肌肉组织表达量的15.6%，改善了患者6min步行试验(6MWT)距离[22]，然而Ⅱ和Ⅲ期临床试验结果未发现有统计学意义的临床指标改善(如6MWT)[23]，2016年初，美国食品和药物管理局(FDA)拒绝了Drisapersen的上市申请。与此同时，美国SareptaTherapeutics公司开发了AVI－4658(一种PMOANOs，现更名为Eteplirsen)，可以跳过DMD基因51外显子。Ⅰ和Ⅱ期临床试验证实了Eteplirsen的安全性和耐受性，最近的Ⅲ期临床试验证实该药物对于DMD患者运动功能的保持和改善具有一定作用。2016年9月20日，美国FDA批准了新药Exondys51(Eteplirsen)注射液，用于治疗DMD。然而，最近的临床实验显示Eteplirsen虽显著增加了患者的6MWT距离，但是否有突出疗效尚无定论。此外，Eteplirsen无法在人体中长期稳定存在，需终生注射，1例患者1年的治疗成本高达30万美元，费用昂贵[24，25]。

 

　　尽管运用AONs治疗DMD的前景光明，但其疗效尚不明确，在长期治疗过程中提升药物剂量虽然对于提升疗效有一定帮助，但可能会带来严重的不良反应，因此，寻找更为高效的AONs和递送方式是外显子跳跃治疗的发展方向。

 

　　三、基因组编辑技术

 

　　基因组编辑技术应用于基因治疗的基本原理是利用细胞自身的修复机制——非同源末端链接(NHEJ)或同源重组(HR)在原基因座位修复突变基因。工程核酸酶可切割特定序列的DNA双链结构，诱发NHEJ或HR修复断裂点，达到原位基因编辑的目的。归巢核酸内切酶(MGNs)、锌指核酸酶(ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)和成簇间隔短回文重复系统(CRISPR)等都已应用于DMD的治疗研究。

 

　　MGNs也称巨酶或大范围核酸酶，是识别活细胞中独特靶位点的大序列(>12bp)特异性核酸内切酶。2013年，Popplewell等[26]利用慢病毒装载能特异性剪切DMD基因44内含子序列(45号外显子上游)的MGNs，并设计携带DMD基因45～52外显子的同源修复基质，包装入慢病毒载体，共同转染DMD基因45到52外显子缺失的人成肌细胞，经编辑后的成肌细胞可检测到全长抗肌萎缩蛋白mRNA的表达。

 

　　ZFNs和TALENs是由可设计的DNA结合蛋白介导的DNA靶向剪切技术，CRISPR/Cas9技术是由RNA介导的DNA靶向剪切技术，均可实现DNA的靶向剪切。

 

　　2013年，Ousterout等设计靶向DMD基因51外显子的TALEN，修饰患者来源的细胞，经编辑的成肌细胞抗肌萎缩蛋白表达恢复[27]。2015年，该团队又利用ZFNs，敲除人成肌细胞DMD基因51外显子，在诱导分化后的肌纤维中检测到抗肌萎缩蛋白表达，并将编辑后的人成肌细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内，在小鼠肌细胞膜上检测到了人抗肌萎缩蛋白的表达[28]。

 

　　除以上几种基因组编辑技术外，CRISPR/Cas9技术的发展为DMD基因的编辑提供了更多的可能。2016年初，Science同时刊登了3篇相关文章，展现了CRISPR/Cas9基因组编辑技术在DMD治疗上的诱人前景。在这三项研究中，杜克大学研究者运用AAV8病毒载导CRISPR/Cas9，将治疗系统通过肌肉注射的方式注入成年小鼠的腿部肌肉中，敲除了DMD基因23外显子，恢复了抗肌萎缩蛋白表达并提高了肌力，随后通过静脉注射的方式将该系统注入mdx小鼠血液循环，发现该治疗系统可以作用于mdx小鼠所有肌肉包括心肌，这意味着DMD患者过早的死亡终点有望改善[29]。另外，德克萨斯大学西南医学中心的研究者利用CRISPR/Cas9技术改造mdx小鼠生殖细胞，约80%的新生小鼠均为DMD基因23外显子缺失，但是该技术应用于人类胚胎尚需伦理学探讨；随后，他们通过腹腔注射、肌肉注射和眼后部注射几种方式，将载导CRISPR/Cas9系统、具有肌肉亲和力的AAV9注入mdx小鼠体内，发现骨骼肌和心肌中抗肌萎缩蛋白表达水平上升[30]。与此同时，哈佛大学研究人员也利用AAV9载导的CRISPR/Cas9敲除了mdx小鼠DMD基因23外显子，修复了部分抗肌萎缩蛋白的表达，并发现该治疗系统距离注射部位较远的肌卫星细胞也有一定作用[31]。

 

　　基因组编辑技术是最新的、在mdx小鼠中表现出良好治疗潜力的DMD治疗手段，但仍有许多问题需要解决。首先，目前所有的体内基因组编辑实验均在mdx小鼠体内进行，基因组编辑技术应用的核酸酶需识别特定的靶向DNA序列，适用于小鼠DMD基因序列的试剂并不一定适用于人类，且mdx小鼠的症状较人类轻，在患者中的疗效尚未可知。其次，基因组编辑技术中细菌来源的核酸酶、基因修复后表达的有功能的抗肌萎缩蛋白，可能会引起人体免疫应答，需要进一步的实验证实其应用于人体的安全性和有效性。最后，基因组编辑系统的脱靶会导致非目标区域的DNA编辑，可能会造成不相关蛋白功能缺失或过度激活，引发不可预知的不良反应。

 

　　基因替代疗法和基因组编辑技术治疗DMD都需要病毒载体介导，除病毒的容量、稳定性外，如何大量生产可满足实际治疗需求的AAV载体、降低治疗成本，也是DMD基因治疗需要解决的实际问题。此外，DMD基因的表达具有组织特异性，使用高肌肉亲和性载体或肌肉特异性启动子，提高转染效率，是DMD基因治疗进一步优化的方向之一。

 

　　总之，基因替代疗法、基因组编辑技术和外显子跳跃技术都有着各自的优势和不足之处，需要更进一步优化和更多的研究支持，为其早日进入临床治疗阶段打下坚实的基础。