极低出生体重早产儿尿代谢组学研究

　　极低出生体重(verylowbirthweight，VLBW)儿是指出生体重低于1500g的新生儿，多数出生胎龄小于33周。不同国家VLBW儿的出生率各不相同，美国约为1.5%，国内流行病学调查结果显示发生率为0.7%[1，2]。前期研究普遍认为胎儿时期的营养状况能够对机体的代谢状态产生永久性的影响，其通过程序性调控机制调节成年期疾病的发生。此外，营养过剩及生后早期的生长过快均可能导致成年期胰岛素抵抗及2型糖尿病等代谢综合征的发生[3，4]。与健康足月儿相比，VLBW早产儿由于其出生胎龄低、体重小及消化系统发育不成熟，导致早期营养普遍摄入不足，是发生神经系统后遗症和发育损害的高危人群。代谢组学能够直观的呈现生物体的代谢图谱，对于全面理解机体在应对疾病和外界刺激所产生的特异性代谢变化具有重要意义[5，6]。因此，采用基于气相-色谱质谱(GC-MS)技术的代谢组学方法对VLBW早产儿和健康足月儿尿代谢产物进行分析，旨在研究VLBW早产儿与健康足月儿在代谢水平的差异，直接有效地评估VLBW早产儿营养状态，进而更有针对性的改善和探索最佳营养方案。

 

　　对象和方法

 

　　一、对象

 

　　采用前瞻性病例对照研究，选择2014年全年中山大学附属第六医院出生的新生儿为研究对象，根据出生体重和胎龄分为VLBW早产儿组和健康足月儿对照组(简称足月儿组)。参考人民卫生出版社《临床流行病学与循证医学》教材中临床研究样本量估算方法设定样本例数。

 

　　VLBW早产儿组入选标准：(1)为单胎活产儿(体重1000～<1500g，胎龄28～<37周)，非意外引起的早产，无先天畸形和遗传代谢病，无围生期窒息史，出生后一般情况良好，无需复苏或抢救；(2)母亲既往无严重内、外科疾病史(糖尿病、妊娠期高血压疾病等)，无感染性疾病史，无营养不良病史，无酗酒、吸烟、吸毒及滥用药物史；(3)母亲至少在当地居住1年以上。足月儿组纳入标准：与早产儿在同一医院出生的健康单胎活产的新生儿(体重≥2500g，胎龄>37周)，无出生缺陷和疾病，母亲要求同VLBW早产儿组。

 

　　剔除标准：(1)家长要求终止研究或提前出院；(2)研究过程中出现严重并发症(如脓毒症、坏死性小肠结肠炎、新生儿呼吸窘迫综合征、严重代谢紊乱等)或死亡。

 

　　本研究获得中山大学附属第六医院伦理委员会的批准(L2016016)，所有尿液样本的采集均获得新生儿家属的知情同意。

 

　　二、方法

 

　　1．尿液标本收集：

 

　　入选新生儿均于出生后24h内收集尿液2ml，尿液标本储存于－20℃冰箱内，于1周内进行检测。

 

　　2．样品处理及GC-MS分析条件：

 

　　按文献[7]的方法进行尿代谢产物分析，检测173种常见代谢产物。GC-MS联用仪(日本电子，Q1000)，色谱条件：不分流进样，进样量1μl，进样口温度260℃，离子源温度200℃，接口温度220℃。程序升温起始温度60℃，保持2min，以17℃/min升至220℃，以15℃/min升至325℃，保持10min。载气为氦气，载气流速1ml/min。质谱条件：电离方式电轰击电离(EI)；电子能量70eV；质谱扫描范围：50～650m/z；扫描方式为全扫描方式。

 

　　3．数据采集：

 

　　根据质谱峰的m/z进行定性，因质谱峰强度与其代表的化合物含量成正比，通过测定离子峰的强度，即可进行分析。

 

　　三、统计学处理

 

　　采用定量分析软件自动计算出所测样品代谢产物的浓度值，对GC-MS检测到的物质进行t检验，获得差异有统计学意义的物质输入在线分析网站进行代谢通路的富集；利用SIMCA-P12.0数据处理软件进行平均值中心化处理后，采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型对两组尿代谢产物进行模式识别并寻找关键差异代谢物。评价OPLS-DA模型匹配度的3个关键指标(R2X表示X矩阵解释率；R2Y代表Y矩阵解释率，二者共同反映模型稳定性；Q2代表模型预测性，三者各大于0.5表明模型匹配良好，越接近1说明模型的匹配度越高)。根据OPLS-DA模型所有变量S-plot图越偏向两端的物质，其协方差和相关性越大，以此筛选差异代谢物。两组计量资料用&plusmn;s表示，比较用t检验；计数资料比较用χ2检验；P<0.05表示差异有统计学意义。

 

　　结果

 

　　1．两组基本资料：

 

　　根据纳入标准和排除标准共纳入VLBW早产儿组20例，其中男11例、女9例，出生胎龄28～33＋1周，平均(30.1±2.0)周，出生体重1001～1450g，平均(1240±136)g；选择同期出生的健康足月儿20名为对照组，其中男9名、女11名，出生胎龄37～40周，平均(38.7±0.9)周；出生体重2850～3850g，平均(3265±243)g。VLBW早产儿组与足月儿组出生胎龄、出生体重比较差异有统计学意义(t＝－17.970、－32.408，P＝0.000、0.000)，两组性别差异无统计学意义(χ2＝0.400，P＝0.527)。

 

　　2．代谢通路分析：

 

　　对GC-MS检测到的173种物质进行t检验，获得差异有统计学意义的物质48种(表1)，输入在线分析网站进行代谢通路的富集，选择差异有统计学意义的通路，分别是氨酰tRNA合成(P＝0.000，该通路中物质有缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸)，赖氨酸合成(P＝0.031，该通路中物质有赖氨酸、2-氨基己二酸)与降解(P＝0.007，该通路中物质有赖氨酸、戊二酸、2-氨基己二酸)，脂肪酸合成(P＝0.008，该通路中物质有硬脂酸、肉豆蔻酸、软脂酸)，嘧啶代谢(P＝0.014，该通路中物质有乳清酸、二氢尿嘧啶、二氢胸腺嘧啶)，泛酸盐和辅酶A合成(P＝0.022，该通路中物质有缬氨酸、二氢尿嘧啶)，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成(P＝0.022，该通路中物质有缬氨酸、亮氨酸)与降解(P＝0.031，该通路中物质有缬氨酸、亮氨酸)及甘油酯类代谢(P＝0.046，该通路中物质有甘油、甘油酸)共9条代谢通路，其中最显著的是氨酰tRNA合成通路。进一步分析代谢通路中物质变化情况，与足月儿组相比较，只有甘油酯类代谢通路中的甘油酸在VLBW早产儿组是高的，而其余8条通路中所有代谢物在VLBW早产儿组中均呈显著下调表达(表2)。

 

　　表1

 

　　GC-MS检测到差异有统计学意义的48种物质在VLBW早产儿组和足月儿组分布(±s，n＝20)

 

　　表2

 

　　9条代谢通路中物质变化情况VLBW早产儿组和足月儿组比较(±s，n＝20)

 

　　3．尿代谢图谱模式识别：

 

　　图1A为尿代谢全谱数据的OPLS-DA图，该模型参数R2Xcum＝0.798，R2Ycum＝0.719，Q2＝0.536。图1A可看出VLBW早产儿组和足月儿组各分布在两个区域，表明两组之间尿代谢组存在显著差异。由图1B可看出，位于S-Plot图两极的共有12个物质(红色三角标记)，其中5个偏正极方向，分别为硬脂酸、软脂酸、肉豆蔻酸、β-氨基丁酸和尿酸，表明这些代谢物浓度随着妊娠时间的增加而升高，其中硬脂酸偏正极最远距离，说明其变化幅度及相关性最大；反之，肌醇、甘露醇、甘氨酸、葡萄糖1、葡萄糖2、甘油酸和N-乙酰酪氨酸7个物质偏负极方向呈负相关变化，即这7种代谢物浓度随着妊娠时间的增加而降低；图1C对S-Plot图潜在的生物标志物进行了热图分析，颜色的深浅代表物质的浓度，从图中可清楚地看出相比较于足月儿对照组，硬脂酸、软脂酸、肉豆蔻酸、β-氨基丁酸、尿酸5种代谢物在VLBW早产儿组中明显少，N-乙酰酪氨酸、肌醇、甘露醇与甘油酸4种代谢物则明显多，而甘氨酸和葡萄糖则差异无统计学意义。

 

　　图1

 

　　重要生物标志物识别A：VLBW早产儿和足月儿组尿代谢物的正交偏最小二乘判别分析得分图，代表的是各组别的空间分布情况；B：所有变量的S-Plot图；C：重要代谢物的整体热图

 

　　讨论

 

　　以往临床研究中，通过传统分析方法只能检测极少数代谢物，大大限制了对新生儿代谢谱的全面认识。包括GC-MS在内的质谱技术具有灵敏度高、特异性强和一种实验检测多种代谢物的特点，在全世界范围内得到广泛应用。在许多研究中，用此技术对尿液、羊水和细胞等样本中的氨基酸、有机酸、脂肪酸和类固醇激素等代谢物进行检测[8]。

 

　　本研究采用GC-MS技术对VLBW早产儿和健康足月儿样本尿液进行检测和比较，共获得173种小分子代谢物，并进一步富集到9条显著的代谢通路，并发现VLBW早产儿几乎全部通路(8/9)中的物质均呈下调变化，体现了VLBW早产儿的代谢功能不完善，表明早产和低出生体重对于胎儿体内各种物质储存和代谢过程具有重要影响。值得注意的是，VLBW早产儿生后氨酰tRNA合成通路下调最为明显，反映了其体内蛋白质合成不足，或由于胎儿宫内生长发育依赖母体经胎盘供给营养，出生后来自母体的各种营养素被终止，而此时又没有及时建立胃肠内外营养，为了满足机体代谢的能量需求，体内储存的蛋白质将被迅速分解。因此，Poindexter等[9]提出，早产儿应早期积极摄入氨基酸，以增强蛋白质合成、抑制蛋白质分解，促进其生长发育。本研究也支持这一观点，为超和(或)极低出生体重儿早期营养干预方案提供了基础。另外，本研究发现VLBW早产儿组甘油酯类代谢比足月儿略高，但由于样本量偏少，其临床意义有待进一步验证。

 

　　为了筛选VLBW早产儿代谢生物标志物，本研究通过代谢物S-Plot分析，发现其尿代谢产物浓度普遍呈下调表达趋势，可能与早产儿本身低代谢状态或肾功能发育不成熟有关。为了缩小寻找生物标志物的范围，参考Wiklund等[10]报道的方法，选取位于S-Plot图两极的物质，共发现12个潜在生物标志物，其中脂肪酸代谢相关的硬脂酸，软脂酸，肉豆蔻酸等代谢物在VLBW早产儿显著少。其可能原因有三：一是胎龄不足导致体内脂肪酸贮备较少，已有研究表明对VLBW儿仅用无脂肪静脉营养72h内，就出现了必需脂肪酸的缺乏[11]；二是VLBW儿早期胰脂酶活性低下，胆酸和胆盐分泌少，酯酰肉碱水平低，其利用脂肪酸的能力有限；三是可能与长链脂肪酸氧化所必需的游离肉碱摄入不足有关。

 

　　胎儿主要在胎龄近37周时开始迅速贮备肝糖原，VLBW早产儿因其胎龄小、糖异生、生酮作用和肝糖原分解机制不成熟等原因导致其出生后相较于健康足月儿更容易发生低糖血症[12]。而本研究筛选到的生物标志物尿葡萄糖在VLBW早产儿却呈现升高趋势，其原因往往是临床上医生担心早产儿或VLBW发生低血糖而补充过量有关。