BPD的全基因组关联分析！

　　BPD的全基因组关联分析！

　　早产是围产期并发症甚至死亡的主要原因。由于卫生医疗条件的提高、儿科重症监护工作的开展，早产儿存活率上升，但早产会累及较晚发育的组织与器官，包括神经系统和肺，发生脑室内出血、坏死性小肠结肠炎和支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasia，BPD)。存活的早产儿容易出现长期的健康问题，严重影响患儿生活质量，给家庭与社会带来沉重负担[1]。现就BPD遗传分析的国内外新进展进行综述。

　　一、BPD

　　BPD是一个发展概念，有“旧”和“新”两个内容[2]。“旧”的BPD概念是1967年提出的，以肺间质纤维化和呼吸道鳞状上皮细胞化生重构以及弥漫性炎症反应为特征。主要是呼吸窘迫综合征新生儿在接受正压机械通气和高浓度氧疗后发生的。“新”的BPD概念以肺泡简单化和肺微血管异常为特征，这些组织特征是由于早产造成肺的发育过程被阻断形成的。重症监护能力的提高(保护性机械通气)以及表面活性物质和产前皮质激素的使用极大地有助于早产儿和低体重新生儿的存活，现在BPD以新类型为主。综合胎龄和需氧情况，BPD临床上分成轻度、中度和重度[3]。

　　肺的发育相比于其他器官要晚，从孕4周才开始。肺的发育可以分为4个阶段，分别是假腺期(孕4～17周)，小管期(孕17～26周)，囊泡期(孕24周至出生)和肺泡化期(36周至出生后)[4]。在最后的肺泡化阶段，囊泡状的肺通过形成肺泡间隔，极大地增加了肺的表面积。超早产儿(孕22～28周)的肺可能只发育到小管期，这个时期的胎肺刚开始具有弱的气体交换的功能，不能满足早产儿呼吸的需要。研究表明，最后一个阶段肺泡化期可以一直延续到儿童甚至少年时期[5]。

　　临床上尚无可以治愈BPD的药物，BPD的发生与出生胎龄和出生时体重负相关，过去10多年来BPD发生率一直维持在30%～50%[6]。BPD不仅影响新生儿生存，而且患者在儿童期甚至到成年都会存在肺功能差的问题[7]。为了更好地对BPD进行预防与治疗，有必要更全面地了解BPD发生有关的危险因素，特别是遗传方面的因素。

　　二、BPD具有显著的遗传学基础

　　双胞胎研究方法是研究复杂疾病遗传性的经典方法，可以确定遗传和环境因素分别对复杂疾病的影响。对108对出生体重低于1500g的双胞胎的研究[8]定义BPD为出生后28d仍需氧支持，同时伴有肺部影像异常和呼吸急促现象；数据分析发现这些双胞胎中，两例均发生BPD的几率是65%，仅1例发生BPD的几率是8%，远低于该研究中新生儿的BPD发生率(23%)。遗憾的是该研究并没有考虑同卵或异卵的因素，分析结果无法排除双胞胎相同的环境因素的作用。该研究把BPD发生的危险因素指向了遗传方面。

　　2006年发表了一项关于450对胎龄不超过32周(平均出生胎龄29周，平均体重为1286g)的双胞胎的回顾性研究[9]，其中BPD定义为矫正胎龄36周仍需氧支持。数据分析表明男性、低出生体重或者患有呼吸窘迫征是新生儿发生BPD的独立危险因素。比较63对同卵与189对异卵双胞胎的数据发现，在同卵双胞胎中BPD的发生率明显比异卵双胞胎中高。该研究首次明确BPD的发生与遗传的关系，并且BPD的遗传易感性的影响达到53%。这一结论得到了其他实验室独立研究结果的支持[10]。在318对双胞胎中，同样观察到同卵双胞胎发生BPD的一致性比异卵双胞胎要高，遗传对BPD的影响更是达到79%。以上研究确立了遗传因素对BPD发生的显著影响，但是双胞胎研究方法不能发现特定的遗传标志物。BPD易感基因的分析还需要借助其他遗传学研究方法。

　　三、BPD的遗传易感性与关联基因

　　1．候选易感基因与BPD关联分析：

　　众多研究试图建立已知分子或者通路与BPD的关系，这些分子或通路与肺的发育[SFPTs，维生素D受体(VDR)]，炎症反应[Toll样受体，白细胞介素(IL)－4，IL－13，IL－18，肿瘤坏死因子(TNF)－α，干扰素(IFN)－γ，巨噬细胞游走抑制因子(MIF)]，肺纤维化[基质金属蛋白酶(MMPs)]，血管新生[血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(VEGFR)]，氧化应激[超氧化物歧化酶(SODs)、谷胱甘肽S转移酶(GST)M1、GSTT1]以及肺的损伤修复有关。Shaw和O‘Brodovich[11]对2006年以来候选基因的单核苷酸多态性(SNP)与BPD的关系分析进行了详细总结；Lal和Ambalavanan[12]做了进一步的更新。根据BPD发生的血管形成缺陷假说，肺部毛细血管的形成是肺发育过程的最后一步肺泡化的重要内容并且促进肺泡化过程中肺泡间隔的形成[13]。BPD的肺泡化过程阻滞与肺部毛细血管发育异常有关[14]。VEGF在血管生成过程中发挥了重要的作用，BPD患者的VEGF的转录水平显著下降[15]，这些证据使得VEGF在BPD遗传中的表现备受关注。其中一项研究募集了160例胎龄不足30周的新生儿，其中包含44例中、重度BPD患儿，在选取的6个VEGF－A和25个VEGFR2常见SNP位点中，发现VEGFR2的1个多态性位点(rs4576072)与中、重度BPD的发生存在关联；以上纳入研究的160例新生儿的父母都是芬兰北部芬兰人，遗传异质性低。为了进一步证实该位点与BPD的关系，研究者另外募集了328名来自芬兰和加拿大的新生儿(含120例中、重度BPD)进行相同的分析。结果表明在遗传异质性高的人群中，所选的VEGF－A和VEGFR2SNP位点与BPD都不存在显著性关联关系[16]。另一项在日本人群中进行VEGF与BPD关系的研究，共募集了55例BPD新生儿和42例无BPD的对照，结果表明在VEGF6个常见变异中，其中1个5’非翻译区的多态性(－634C>G，rs2010963)与BPD的发生显著相关[17]。对候选基因在BPD发生中的作用不同研究组结果不同的可能原因有：样本数少，多数研究募集的人群都是来自一家医院；研究人群存在明显的人种差异，有研究表明人种之间的遗传差异影响肺的发育过程，因此不同的人种可能存在不同的BPD遗传易感性[18]；BPD本身存在很大的复杂性与异质性。候选基因的选择是基于肺与血管的发育与功能的研究基础上选择的，虽然目前为止这方面的研究很多，但由于存在上述多种原因，仍没有找到一个明确的BPD致病基因。

　　2．BPD的全基因组关联分析(genome－wideassociation，GWA)：

　　候选基因在BPD中的研究揭示了BPD发生在遗传上的复杂性和异质性。GWA适合研究复杂性状(包括疾病)的遗传。Hadchouel等[19]首次把GWA的方法引入到BPD的研究中，并发现胞外基质蛋白睾丸蛋白聚糖(SPOCK)2是BPD的易感基因。SPOCK2又名SPARC，是一个转化生长因子(TGF)β1调控产物。体内和体外研究发现，在肺发育的最后阶段——肺泡化过程中，其表达升高，说明SPOCK2可能与肺泡成熟有关。在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化过程中，其表达也上升。而在SPARC基因敲除的小鼠，博来霉素诱导产生的肺纤维化程度降低[20，21]。这些研究表明SPARC参与肺发育过程以及肺纤维化过程。SPARC基因与BPD的关系还需进一步研究，比如研究SPARC基因敲除的新生小鼠是否容易发生高氧诱导的肺组织损伤。其他独立开展的GWA没有发现新的BPD易感基因，也没能重复上述报道的SPOCK2或SPARC基因与BPD的关系[22]。可能与GWA设定的太高显著性要求(5×10－8)有关，比如在最近的一项GWA研究中，发现腺嘌呤脱氨酶，CD44等基因与BPD有关，但是分析结果均未达到GWA所要求的显著性水平(5×10－8)[23]。该研究对BPD相关通路分析，结果表明临床上的BPD分级(轻度、中度和重度)可能不是BPD疾病发展的3个阶段，而是不同的病理表现，并具有不同的遗传因素。以上GWA同样存在研究对象人种和BPD定义的差异，纳入分析的样本数偏少。GWA的不成功再次说明了BPD的复杂性，并且其遗传可能与稀有变异的关系更强。

　　3．BPD的全外显子测序分析：

　　GWA也确实为多种复杂疾病发现了大量的常见变异，GWA的不成功表明GWA的设计基础“常见疾病－常见变异”假说不适用于BPD。“常见疾病－常见变异假说”指出常见变异是疾病的主要危险因素。现在有越来越多的研究表明一些复杂疾病是由稀有变异造成的。在新一代测序技术基础上发展起来的全外显子测序方法可以用来搜寻与性状和疾病有关的稀有突变。首项初步研究对26例意大利重度BPD患者进行全外显子测序和分析，发现了多达3369个新的变异，其中突出的是NOS2，MMP1，CRP，LBP和TLR家族基因[24]。另一项全外显子测序研究，发现258个基因发生了罕见的突变[25]。进一步分析表明这些基因多与肺的形态发生与功能相关，包括胶原纤维高级结构的组织过程，胚胎上皮组织的形态发生以及Wnt信号通路这三个方面。更重要的是，这三个方面都与肺发育的最后一步肺泡化过程相关。外显子测序虽然能够发现常见的变异，也能发现稀有变异，但是也存在一些问题。一是其测序的对象是基因的编码区，而在人的基因组中，编码蛋白的序列占全部序列的2%以下，非编码序列的重要功能正受到越来越多的关注。二是全外显子测序结果的分析目前还处于开始阶段，还没有完善的成熟数据处理软件对测序的结果进行深度挖掘。

　　4．BPD的表观遗传：

　　遗传除了传统的DNA序列发生改变的内容外，还有表观遗传的内容。表观遗传是指在基因组DNA序列之外的可遗传的因素，包括DNA甲基化修饰、组蛋白甲基化、乙酰化、泛素化和磷酸化等修饰以及非编码的RNA等。BPD的发生除了遗传因素的作用外，表观遗传也发挥了一定的作用。通过比较新生与成年小鼠肺组织之间以及BPD患儿与正常新生儿之间DNA甲基化修饰情况，发现有20个基因与3条通路的甲基化修饰的变化在动物模型与BPD患者中是一致的[26]。对影响BPD的通路进行分析发现非编码mir－219可能参与BPD的发生，与此一致的是mir－219靶向的基因多参与组织重构[23]。这些结果表明表观遗传因素也参与了BPD的发生，BPD的表观遗传因素可能与胎儿或新生儿所处的环境特别是子宫内的环境有关，但尚缺乏对BPD的表观遗传因素的深入研究。

　　BPD是一种多病因的疾病，是遗传与环境因素相互作用的结果，其中遗传因素占了很大的比例。GWA没能取得很大进展，候选基因的多态性关联分析所获得的结果很少能够被其他实验室重复。外显子测序分析刚开始在BPD中运用，还存在数据的合理挖掘的问题。BPD的遗传学可能不符合“常见疾病－常见变异”的经典假说，稀有变异发挥了更为重要的作用。现有研究也表明BPD的遗传由多个基因决定，具有很大的异质性。目前找到的可能相关基因涉及血管新生、炎症以及组织重构等通路，结合BPD的病理表现为肺发育后期重要的肺泡化过程受到阻滞，这些基因关联性分析结果具有一定的参考性。但BPD的遗传学研究尚未发现明确的疾病关联基因。

　　治疗水平的提高以及一些辅助性治疗显著地提高了BPD患儿的存活率，但是近年来国外BPD患儿的存活率达到了平台期，没有继续提高。BPD的遗传因素起了很大的作用，遗传因素的揭示有助于治疗工作的开展。除了遗传因素外，BPD的发生还有环境因素，比如氧疗中氧气的浓度，辅助通气中的正压、感染和炎症的控制等。这些环境的因素是国内治疗工作中需要重点关注和排除的。