【儿科精准医学】PCDH19基因突变导致的女性Dravet综合征的基因型和表型特点！

　　【儿科精准医学】PCDH19基因突变导致的女性Dravet综合征的基因型和表型特点！

　　摘要

　　目的

　　探讨PCDH19基因突变阳性的女性Dravet综合征(DS)患儿的基因型和表型特点。

　　方法

　　前瞻性收集2005年2月至2015年5月在北京大学第一医院儿科就诊的DS患儿及其家系成员的临床资料和外周血DNA。以SCN1A基因突变筛查阴性的女性DS患儿为研究对象，采用Sanger测序的方法筛查PCDH19基因突变，分析PCDH19基因突变阳性女性患儿的基因型和临床特点。

　　结果

　　共收集75例SCN1A基因突变阴性的女性DS患儿，其中6例发现PCDH19基因杂合突变，突变率8%(6/75)；5例为新生突变，1例为遗传性突变。共检测到5种突变类型，均位于第1外显子，其中错义突变3种，碱基插入突变2种。6例携带PCDH19基因突变的患儿起病年龄为5～9月龄，平均6.8个月；首次发作由发热诱发者4例，接种疫苗后发作1例，无热发作1例。6例病程中表现为多种发作类型，均有全面强直－阵挛发作和局灶性发作，3例有肌阵挛发作，不典型失神发作和失张力发作各1例。6例患儿病程中癫痫发作均有热敏感和丛集性的特点，均有智力发育落后；2例有孤独症样表现，3例有共济失调。

　　结论

　　PCDH19是继SCN1A之后DS的另一个重要致病基因，且以新生突变为主，该基因突变导致的女性DS患儿以全面强直－阵挛发作和局灶性发作为主，发作具有热敏感和丛集性的特点，且多数发作持续时间短，常有智力发育落后，部分可有孤独症样表现。

　　Dravet综合征(DS)是一种难治性癫痫综合征，国外报道其发病率约为1/22000[1]。DS的临床特点为1岁以内多以热性惊厥起病，表现为反复的全面性或半侧阵挛发作，1岁以后出现多种类型的癫痫发作，发作具有热敏感的特点，且易发生癫痫持续状态。已证实编码电压门控钠离子通道α1亚单位的基因SCN1A是DS的主要致病基因，突变阳性率为70%～80%[2，3]。近年来研究发现少数SCN1A基因突变阴性的女性DS患儿携带PCDH19基因杂合突变[4，5]。PCDH19基因相关的癫痫属于特殊的X连锁遗传方式，即携带PCDH19突变的杂合子女性受累，而携带突变的半合子男性不受累。本研究对2005—2015年北京大学第一医院临床诊断为DS且SCN1A基因突变阴性的女性患儿筛查PCDH19突变，总结PCDH19基因突变导致的女性DS患儿基因型和表型特点，为临床早期识别本病提供线索，为患儿家庭遗传咨询和产前诊断提供指导。

　　对象和方法

　　一、对象

　　前瞻性收集2005年2月至2015年5月在北京大学第一医院儿科神经专业门诊及病房诊治的DS患儿，每例患儿建立临床信息登记表并由监护人签署知情同意书，收集患儿及其父母的临床资料和外周血DNA筛查SCN1A基因突变，以SCN1A基因突变筛查阴性的女性DS患儿作为研究对象。该研究已通过医院伦理委员会的批准，编号：2012[453]。

　　DS患儿入选标准[6]：(1)1岁以内起病，首次发作多表现为发热惊厥；(2)持续时间较长的全身或半侧阵挛发作，常为发热诱发；(3)1岁后出现多种形式的无热惊厥，包括全面性或半侧阵挛或强直阵挛发作、肌阵挛发作、不典型失神、局灶性发作等；(4)发作具有热敏感的特点；(5)病程中常有癫痫持续状态；(6)早期发育正常，发病后逐渐出现智力运动发育落后或倒退，可出现共济失调和锥体束征；(7)脑电图在1岁以前常无异常，1岁以后出现广泛性棘慢波、多棘慢波或局灶性、多灶性痫样放电；(8)对抗癫痫药物疗效差。

　　二、方法

　　1．PCDH19基因突变筛查：

　　采用Miller改良盐析法提取外周血白细胞基因组DNA。对PCDH19基因全部6个外显子及内含子－外显子连接处共设计10对引物，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。采用PCR和DNA直接测序的方法筛查PCDH19基因突变。测序结果与人类基因PCDH19序列进行比较(Genbank序列号NM_001184880.1)。对发现的突变，依据PCDH19基因突变数据库(http：//www.lovd.nl/PCDH19)和ExomeVariantServer(http：//evs.gs.washington.edu/EVS/)来确定是否新突变，用Polyphen2(http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/dokuwiki/about)，SIFT(http：//sift.jcvi.org/)和MutationTasterServer(http：//www.mutationtaster.org)进行蛋白质结构破坏和疾病诱发可能性的分析。如发现基因突变者进一步对患儿父母进行检测，对于未报道过的新突变，则对100名正常对照DNA进行该突变的检测。

　　2．随访：

　　所有患儿通过门诊复诊或电话随访获取随访资料，包括临床表现、视频脑电图(VEEG)、治疗和预后。

　　三、统计学处理

　　患儿PCDH19基因突变率用%表示。

　　结果

　　一、PCDH19基因突变筛查结果

　　共收集DS患儿547例，均进行SCN1A基因突变筛查，阳性386例，阴性161例(男86例、女75例)。SCN1A基因突变阴性的75例女性DS患儿中6例PCDH19基因突变，突变阳性率为8%。共检测到5种不同类型的PCDH19基因杂合突变(c.488T>G/p.V163G、c.1347_1348insAAC/p.N449_H450insN、c.1019A>G/p.N340S、c.695G>A/p.N232S和c.1091dupC/p.Y366LfsX10)，均位于该基因第1外显子，其中错义突变3种(c.488T>G/p.V163G、c.1019A>G/p.N340S和c.695G>A/p.N232S)，碱基插入突变2种(c.1347_1348insAAC/p.N449_H450insN和c.1091dupC/p.Y366LfsX10)。突变c.1019A>G/p.N340S、c.695G>A/p.N232S和c.1091dupC/p.Y366LfsX10为已报道的致病突变；而突变c.488T>G/p.V163G和c.1347_1348insAAC/p.N449_H450insN是新突变。两种新突变在100名正常对照中均未发现。5种突变位点分别用PolyPhen2、SIFT和MutationTaster软件进行突变功能预测，均为致病性突变。突变c.1019A>G/p.N340S见于2例患者，分别出现在1例散发病例和1例母亲有癫痫伴智力低下家族史的病例中。6例患儿除1例为突变遗传自母亲外(进一步研究证实其母亲为新生突变)，其余5例均为新生突变(表1，图1)。

　　图16例女性DS患儿及家系成员PCDH19基因测序图A：例1患儿c.488T>G(箭头)突变，患儿父、母c.488T(箭头)均未发生突变；B：例2患儿c.1347_1348insAAC(箭头)突变，患儿父、母c.1347_1348(箭头)均未发生突变；C：例3患儿c.1019A>G(箭头)突变，患儿父、母c.1019A(箭头)均未发生突变；D：例4患儿c.1019A>G(箭头)突变，患儿母亲c.1019A>G(箭头)突变，患儿外祖母和外祖父c.1019A(箭头)均未发生突变；E：例5患儿c.695A>G(箭头)突变，患儿父、母c.695A(箭头)均未发生突变；F：例6患儿c.1091dupC(箭头)突变，患儿父、母c.1091(箭头)均未发生突变

　　二、临床特点

　　6例PCDH19基因突变的女性DS患儿起病年龄5～9月龄，平均6.8个月(表2)。首次发作由发热诱发者4例，其中1例为低热诱发；接种百白破疫苗后发作1例；无热发作1例。首次发作形式为全面强直－阵挛发作(GTCS)4例，局灶性发作继发GTCS2例，其中4例首次发作即呈丛集性(即24h内发作≥2次)；病程中表现为多种发作类型，均有GTCS和局灶性发作，3例有肌阵挛发作，有不典型失神发作和失张力发作各1例(表2)。6例患儿病程中癫痫发作均有热敏感和丛集性的特点，24h内发作次数可达5～40次，丛集性发作时可伴发热或无热。发作持续时间多<5min，仅其中1例病程中出现2次发热诱发的癫痫持续状态。

　　6例患儿就诊时均有智力发育落后，语言表达明显落后，例3和例4伴有孤独症样表现。例1、4、5有步态不稳，共济失调。例4有癫痫家族史，其母亲为癫痫伴智力低下患者，2岁半出现发作(具体形式不详)，呈热敏感和丛集性，最多时1d发作40余次，服丙戊酸和苯巴比妥治疗，13岁后再未发作。其余5例为散发病例。

　　6例患儿病程中均行4hVEEG检查，最多1例检查3次。发作间期背景活动慢2例(例1、6)，监测到局灶性或多灶性放电者5例，放电可位于一侧或双侧的额、颞、中央区。其中3例监测到临床发作：例1发作同期脑电图为右侧中央，顶区起源的局灶性放电；例5监测到3次发作，2次为右侧起源的局灶性放电(5月龄和7月龄)，分别起源于右侧中央区和右侧额、中央、后颞区，1次为肌阵挛发作继发GTCS(14月龄)；例6监测到2次GTCS(11月龄)。6例患儿头颅磁共振成像(MRI)均正常。

　　三、治疗和随访

　　6例患儿末次随访时年龄1岁3月龄至18岁，均尝试多种抗癫痫药物治疗，包括丙戊酸、托吡酯、左乙拉西坦(LEV)、氯硝西泮、卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪和苯巴比妥。例1服用丙戊酸和托吡酯后发作减少，每年发作1～2次，末次随访12岁，行走不稳。例2服用丙戊酸和托吡酯后发作减少，曾3年7个月无发作，但遇发热偶有发作，末次随访18岁，生活能自理。例3用丙戊酸、托吡酯、氯硝西泮和LEV，发作曾控制1年，遇发热再次发作，末次随访9岁，有孤独症样行为。例4、5、6末次随访年龄分别为3岁、1岁6月龄和1岁，曾尝试多种抗癫痫药物治疗效果不佳，末次随访时用丙戊酸、氯硝西泮和LEV仍发作频繁，1～3个月丛集性发作1次。4例(例1、2、4、5)曾用拉莫三嗪、卡马西平、奥卡西平无效，但发作未加重。

　　讨论

　　PCDH19基因定位于染色体Xq22，其编码的原钙黏蛋白19，属于原钙黏蛋白δ2亚家族一员，有6个外显子，包含1148个氨基酸，该蛋白包括1个信号肽，6个位于细胞外的钙黏蛋白重复序列，1个跨膜区域和1个胞质区域，其中第1外显子很大，编码6个胞外域[7]。尽管原钙黏蛋白19的具体功能尚不清楚，但PCDH19基因主要在不同发育阶段的中枢神经系统组织中表达，推测其参与神经元连接的建立，突触膜的信号传递。PCDH19基因(MIM#300460)突变首先由Dibbens等[7]于2008年在7个限于女性的癫痫伴智力落后(epilepsyandmentalretardationlimitedtofemales，EFMR)家系中报道。EFMR主要的临床特点是婴儿期或儿童期起病的癫痫伴智力落后，是一种特殊的X连锁遗传方式的癫痫，家系成员中携带PCDH19基因突变的杂合子女性受累，而携带突变的半合子男性不受累[7，8]，仅有1例男性嵌合体发病的报道[4]。解释这种特殊遗传方式的理论是“细胞干扰”机制，即只有PCDH19突变细胞和野生细胞共存，才会出现临床症状[4]。

　　近年来，有关PCDH19基因突变的文献报道逐渐增多[5，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24]，已发现150多种PCDH19突变类型，包括错义突变、无义突变、碱基缺失或插入突变、剪切位点突变，部分外显子甚至整个基因的缺失或重复[15](http：//www.LOVD.nl/PCDH19)，90%以上的突变发生在第1外显子，且以新生突变为主[24]。本组6例突变均位于第1外显子，其中5例为新生突变，与文献报道特点一致。PCDH19基因突变导致的女性癫痫临床特点为[18]：(1)起病年龄4～60月龄；(2)癫痫发作表现为多种发作类型；(3)发作持续时间短，较少出现癫痫持续状态；(4)临床发作具有热敏感和丛集性特点；(5)伴或不伴智力低下；(6)有或无女性受累的癫痫家族史。PCDH19基因突变患者的临床表型谱具有异质性，不仅可以出现在EFMR家系中，更常见于散发的女性热敏感癫痫患者中，包括散发的EFMR和少数女性DS患者。DS和EFMR的发病年龄有重叠，二者的发作均具有热敏感，且发病后多出现智力发育落后。

　　SCN1A基因突变阴性的女性DS患者PCDH19基因突变率为6.7%～25%[4，5]，本组突变率为8%，表明PCDH19是DS的另一个重要致病基因，对于SCN1A基因突变阴性的女性DS患儿应常规进行PCDH19基因突变筛查，明确病因并指导遗传咨询。PCDH19突变导致的DS患者和SCN1A基因突变导致的DS患者在临床表型上有重叠，包括起病前发育正常，发病年龄早(1岁前)，表现为有热和无热发作，发热易诱发发作，表现多种发作类型，发病后多数患儿智力、运动发育落后[5，21]。但PCDH19基因突变阳性的DS患儿与SCN1A基因突变阳性的DS患儿表型也有不同之处，前者发作持续时间短(<5min)，丛集性发作特点突出，但肌阵挛发作、癫痫持续状态和光敏感性少见，远期预后多数较SCN1A基因突变阳性的DS患儿好[17]。本组6例DS患儿仅1例有发热诱发的癫痫持续状态，而SCN1A基因突变导致的DS患儿绝大多数病程中均有癫痫持续状态。

　　本研究中例1、2、3已随访3～6年，发病早期癫痫发作频繁，伴有智力发育落后，6岁以后癫痫发作逐渐减少，智力落后进展不明显，用丙戊酸和托吡酯治疗后发作明显减少。Specchio等[16]认为抗癫痫药物并不能控制患儿丛集性发作，发作的改善与年龄增长和发热性疾病发生减少有关。本研究中例3和例4的突变一致，例4的母亲携带有相同的突变，且为新生突变，但发作起病年龄为2岁6月龄(具体发作类型不详)，发作具有热敏感和丛集性，至13岁后未再发作，伴有智力发育落后。

　　虽然PCDH19基因突变早期是在有家族史的EFMR患者中发现，但文献报道和本研究均表明，PCDH19突变更多出现在散发的热敏感性女性癫痫患者中，且以新生突变为主。PCDH19基因突变阳性的女性患者和SCN1A基因突变阳性的患者均可表现为DS的临床表型特点。对SCN1A基因突变检测阴性的女性DS患者，应常规进行PCDH19基因突变筛查明确病因诊断，并进一步指导遗传咨询和产前诊断。