肺炎支原体的耐药机制和抗生素选择！

　　肺炎支原体的耐药机制和抗生素选择！

　　肺炎支原体（MP）不仅是学龄期和学龄前期儿童CAP常见病原，在1～5岁儿童中亦不少见。MP感染占社区获得性肺炎的20％以上，一年四季均有病例出现，流行具有周期性，每4～7年在不同地区出现发病率高峰。MP感染除引起原发性非典型肺炎外，还可引起上呼吸道感染、支气管炎、肺脓疡及严重的肺外并发症，如免疫性溶血性贫血、脑膜脑炎、心肌炎、心包炎、肾炎，严重感染者甚至可导致死亡。大环内酯类抗生素是治疗儿童支原体感染的首选药物，但近年来国内外均报道其耐药现象逐渐增加。

　　一、大环内酯类抗生素耐药机制

　　大环内酯类抗生素是多种放线菌属细菌的次级代谢产物。主要结构是以1个大环内酯母核通过羟基，以糖苷键和1个、2个或3个分子的糖连接，按其内酯环结构含碳母核的不同，分为14、15、16元环的大环内酯。临床上常用的14元环的大环内酯类药物有红霉素、克拉霉素、罗红霉素等；15元环的大环内酯类药物有阿奇霉素；16元环的大环内酯类药物有吉他霉素、螺旋霉素、泰洛星、卡波霉素和交沙霉素等。大环内酯类抗生素是一种抑菌剂，其抑菌作用主要是抑制细菌肽的合成和阻止核糖体的组装。核糖体是细菌蛋白质合成的场所，大环内酯类抗生素结合于核糖体50S亚基的转肽酶中心与肽输出通道狭窄之间的部分，通过机械性阻塞通道而抑制肽的延伸，从而阻碍蛋白质的合成。通过核糖体结合试验证实，14元环大环内酯与核糖体的结合位点位于23SrRNA上第2063、2064、2607、2611位。RNA印迹实验提示2063、2064、2505位碱基是红霉素的结合位点。15元环、16元环的大环内酯与14元环大环内酯的结合位点大致相同，为23SrRNA的2062、2063、2064、2616和2607。同时，大环内酯类抗生素抑制核糖体50S亚基的组装，导致有功能的核糖体数量的下降。使细菌蛋白质合成能力下降，细菌生长受到抑制。MP耐大环内酯类药物的机制主要有以下几种：

　　1．基因突变或甲基化

　　MP23SrRNA转肽酶区域明显的基因点突变可导致最低抑菌浓度（MIC）中较高的大环内酯类抗生素抑制。体外诱导的耐药机制主要为基因突变。

　　对于大环内酯类抗生素抗药性的产生是否有甲基化的作用，目前有2种主张。红霉素抗药性的产生，与甲基转移酶Erm家族催化的A2063甲基化有关。另有研究推测MP的耐药机制不存在靶位的甲基化，原因是MP只有1个rRNA操纵子，而通过甲基化获得耐药性的微生物需含有多个rRNA操纵子；且目前在对MP临床分离株及药物诱导的耐药菌株的研究中，只发现了点突变，未发现编码甲基化酶的Erm基因。

　　2．大环内酯类抗生素的主动外排机制药物的主动外排系统主要是由于细胞膜成分的改变，出现一种能将药物排出体外而阻止药物作用于靶部位的膜蛋白，使胞内的有效药物浓度降低，从而降低抗生素阻碍病原微生物蛋白质合成的作用。但是此耐药机制在对MP的耐药性是否有抗生素的主动外排机制参与方面，并没有确切的证据。

　　3．大环内酯类抗生素的修饰、失活目前已知某些细菌可产生大环内酯类抗生素钝化酶，破坏大环内酯类抗生素而使其失去活性。已发现的钝化酶主要有大环内酯2’-磷酸转移酶、红霉素酯酶和大环内酯糖基转移酶。这些酶会破坏大环内酯类抗生素原有的结构，从而改变其药性，使细菌对其耐药。但对于MP尚未见此方面的报道。

　　二、MP耐药株和耐药基因的检测方法

　　对耐药株和耐药基因的诊断和研究，可以为临床MP个体感染者提出选择有效的抗生素治疗建议，特别是为MP感染社区大规模暴发流行提出合理的治疗控制方案。目前用于MP耐药株和耐药基因检测的方法主要有以下几种。

　　1．MIC测定通过检测不同抗生素浓度下MP的生长状态，测定MIC，可初步判定MP是否耐药（按照美国国家临床实验室标准委员会2001年规定的临界浓度判定红霉素的敏感度≤0.25mg／L为敏感，0.25～1.0mg／L为中介，≥1.0mg／L。为耐药）。对抗生素的MIC测定是目前检测支原体是否耐药的最主要的方法，但此方法结果并不精确，培养耗时、费力，且影响因素多，因此只能作为粗略判断病原体是否耐药的依据，无法判断和分析耐药株是否发生基因突变及耐药原因。

　　2．在PCR基础上发展起来的若干技术有力地促进了耐药基因突变的检测

　　（1）PCR或巢式PCR产物的测序应用是目前国内外大部分学者依靠MIC测定初步得到MP耐药株后，进一步检测其耐药机制的最主要的方法。PCR或巢式PCR技术扩增MP－23SrRNAV区域易发生突变的基因片段，并对扩增产物进行测序，将基因序列与Genbank中MP标准株基因序列进行比较，发现耐药株在23SrRNA发生点突变。

　　（2）限制性内切酶片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）如果基因突变涉及到某个限制性内切酶的识别位点，用此酶酶解DNA时便会产生不同长度和数量的DNA片段，进行电泳即可判断是否有突变位点及碱基突变类型，因此MP耐药基因的检测也可采用RFLP分析方法进行检测。RFLP法具有较高的特异性，可以确定突变的部位及性质，重复性较好，操作相对简单，不需要特殊昂贵设备，实验前期准备时间短，能同时对多个样本进行检测；如果所用的限制性内切酶为普通常用酶，在一定样本量的前提下，检测成本也比较低；但其不足之处在于该方法费时、费力，优化酶切条件可能需要较长时间，酶切不完全会严重降低分析的准确率，操作不易实行自动化等。

　　（3）实时荧光定量PCR结合高熔解度朗线分析法在对MP耐药基因的检测中，实时荧光定量PCR结合高熔解度曲线分析法的结果与上述2种方法检测结果一致，但该方法更加快速、方便，且能很好地区分临床标本对抗生素是否敏。但该操作易污染，结果易出现假阳性。

　　三、耐大环内酯类MP的抗生素治疗

　　体外药敏试验发现，A2063G和A2064G突变导致了MP对大环内酯类的高度耐药（红霉素、阿奇霉素、克拉霉素）；目前仍未发现对喹诺酮类和四环素类抗生素耐药的MP株。国内外多项研究发现，感染耐大环内酯类MP的患者相对于对大环内酯类敏感患者来说，症状持续时间长，抗生素治疗疗程长，换药率高，咽部MP-DNA拷贝数下降慢，但耐大环内酯类的MP感染并不一定引起更严重的病情，也很少引起呼吸衰竭。还有多数耐大环内酯类的MP感染患儿未接受有效抗生素治疗，亦痊愈，考虑原因可能与下列因素有关：大环内酯类的抗炎作用；MP感染的自限性；不同大环内酯类药物耐药程度不同。

　　目前在儿童中应用四环素类和大环内酯类药物的研究还非常有限，儿童重症耐大环内酯类MP感染面临着抗生素选择的匮乏，什么情况下可以选用，选择哪一种，用药途径、方法、疗程如何，都让临床医生感到困惑，如果没有合理的用药指导，只会加速耐药株的出现。

　　我国《儿童社区获得性肺炎管理指南（2013修订）》指出，治疗MP感染首选大环内酯类，8岁以上可选择多西环素。但是《指南》同时也明确提到以下一些抗生素使用的问题：（1）氨基糖苷类抗菌药物有明显耳、肾毒性，儿童CAP者应尽量避免使用。（2）喹诺酮类抗菌药对骨骼发育可能产生不良影响，应避免用于18岁以下的未成年人。（3）四环素类抗菌药物引起牙齿黄染及牙釉质发育不良，不可用于8岁以下患儿。（4）根据2010年版《中华人民共和国药典》临床用药须知所示：＜6个月CAP儿童，阿奇霉素疗效和安全性尚未确立，应慎用。

　　1．大环内酯类抗生素针对耐大环内酯类MP，若没有或无法应用其他替代药物时，建议更换另外一种大环内酯类抗生素。

　　有研究发现，耐大环内酯类MP的出现与早期给予大环内酯类药物有关，在使用大环内酯类药物治疗的过程中，有体内诱导出耐药株的可能。又有研究认为阿奇霉素治疗MP感染安全有效，耐药株的产生与不规律用药有关，且耐药率与不规律用药次数呈正相关。

　　我国阿奇霉素使用有过度现象，应引起高度重视，严格掌握适应证并予以足够的疗程，最大限度地减少药物的不良反应及耐药现象的发生。

　　2．非大环内脂类抗生素近年研究较多的是四环素类或喹诺酮类。北京2008～2012年分离的180例耐大环内酯类的MP株体外药敏全部对喹诺酮类和四环素类敏感。日本一个多中心的调查检测11种抗生素对耐大环内酯类MP的体外活性，发现红霉素、克拉霉素、阿奇霉素均高度耐药，MIC≥16ug/ml，而喹诺酮类（加雷沙星、妥舒沙星、左氧氟沙星）均表现出强有力的抗菌活性。

　　对于大环内酯类无效、病情较重的MP感染患儿（部分年龄＜8岁），许多国家都有成功使用四环素类（如米诺环素、多西环素）或喹诺酮类的报道，均未发现明显的不良反应。但这些或者是个案报道，或者非随机对照试验，不足以论证其有效性及安全性。

　　Mullloll等选择18岁以下MP所致社区获得性下呼吸道感染的抗生素（包括大环内酯类、四环素类、喹诺酮类等）与安慰剂治疗效果比较的随机对照试验，结果有7项研究（1912例患儿）纳入此项Meta分析，但结果发现，仍不能明确说明抗生素对于MP所致下呼吸道感染的有效性，抗生素的使用还要综合考虑其不良反应，未来还需要高质量的双盲随机对照试验来评价其有效性和安全性。

　　目前对于儿童耐大环内酯类MP的严重病例仍是采用包括抗生素在内的综合治疗，可在评估治疗效益和风险的基础上，在家长知情同意并签字认可的前提下，谨慎换用四环素类或喹诺酮类抗生素；若没有或无法应用其他替代药物时，应更换另外一种大环内酯类抗生素。