年终盘点：2016流感病毒研究领域突破性进展

 

 

D型流感病毒的入侵分子机制成为世界科学家所关注的焦点，中国科学院微生物所高福院士研究团队在该研究中取得重大进展，相关研究成果已于2016年1月27日在线发表在病毒学领域国际著名杂志《PLoSPathogens》上：研究人员利用结构生物学手段及功能实验研究了D型流感病毒表面唯一的糖蛋白HEF，通过糖点阵芯片实验证明了D型流感病毒能结合9-O乙酰唾液酸受体及其多种衍生物。随后，研究人员解析了D型流感病毒HEF蛋白及其与不同受体类似物的复合物结构，他们发现D型流感病毒HEF的受体结合位点的230-helix和270-loop存在一个开放的通道，而在C型流感病毒HEF相同的位置，230-helix的K235和270-loop的D269形成盐桥相互作用，将270-loop拉高与230-helix相连，关闭了通道（下图）。D型流感病毒HEF蛋白受体结合位点的开放通道使得D型流感病毒能够容纳不同的糖环构象，从而结合9-O乙酰唾液酸受体及其不同衍生物，为其广泛的细胞嗜性提供了结构基础。组织免疫荧光实验表明D型流感病毒HEF能结合人、猪和牛的气管纤毛上皮细胞。考虑到D型流感病毒不仅能够导致牛和猪发病，而且能够在雪貂和豚鼠中传播，必须警惕和防范其对公共安全的威胁。

 

 

2016年3月29日美国佐治亚大学报告说，该校研究人员与法国赛诺菲巴斯德公司合作，开发出一种对多种毒株的甲型H1N1流感病毒都具有防护作用的流感疫苗，在实验鼠上显示可以提供有效防护。

 

甲型H1N1流感病毒最初被称为“猪流感”。目前这种新型流感已经成为季节性流感。疫苗开发小组在美国《病毒学杂志》发表名为：DesignandCharacterizationofaComputationallyOptimizedBroadlyReactiveHemagglutininVaccineforH1N1InfluenzaViruses.他们分析了多种流感病毒毒株的基因序列，利用名为：计算优化广泛反应抗原（COBRA)的技术，开发出了这种新型疫苗，能针对多种H1N1流感病毒毒株提供免疫保护。佐治亚大学研发负责人特德·罗斯介绍说，“目前流感疫苗的一个缺陷是，必须每年预测当年最流行的流感病毒毒株，在此基础上生产当年的流感疫苗”。而此次研发的COBRA疫苗，可以“对付”多种毒株的甲型H1N1流感病毒。

 

 

2016年4月19日，国际学术期刊MolecularTherapy-NucleicAcids在线发表了中科院上海巴斯德研究所抗感染免疫与疫苗研究课题组与匹兹堡大学儿童医院的合作研究成果“Hemagglutinin-targetingArtificialMicroRNAsExpressedByAdenovirusProtectMiceFromDifferentCladesofH5N1Infection”。研究人员将miRNA技术和腺病毒载体结合，研发了新型禽流感防控技术。通过软件设计和细胞体外筛选，科研人员发现一条靶向H5N1HA基因的miRNA，即HA1405，对H5N1病毒具有高效拮抗功能，其中在细胞水平对clade2.3.2H5N1亚型病毒的抑制效果高达96.7%。因此，科研人员将HA1405克隆至复制缺陷型腺病毒载体AdC68的E1缺失区，获得重组腺病毒AdC68-HA1405，以1011vp的重组腺病毒免疫小鼠，可以使4种不同H5N1亚型的流感病毒在感染鼠肺中的含量下降3-40倍，对clade2.3.2、clade2.3.4的H5N1亚型流感病毒的保护效果分别为70%和40%。研究证明，靶向禽流感病毒HA基因的microRNA可发展为防治禽流感的新手段。

 

rAd(HA-1405)providedpartialprotectionfromlethalchallengeofclade2.3.2H5N1inICRmice

 

 

2016年5月6号自然出版集团旗下刊物ScientificReport在线报道了由我国中国科学院武汉病毒研究所崔杰研究员与兰州兽医研究所朱启运研究员、哈尔滨兽医研究所陈化兰研究员的团队合作发表的名为：Co-circulationofH5N6,H3N2,H3N8,andEmergenceofNovelReassortantH3N6inalocalCommunityinHumanProvinceinChina的文章。研究人员针对2014-2015年在湖南某禽养殖场及周边环境收集的流感病毒数据进行分析，发现了3株经由H5N6及其它亚型重配而来的新毒株H3N6。动物实验表明2年内当地流行的4种毒株（H3N2、H3N6、H3N8及H5N6）均有较低的致病力。近年来有报道H5N6能够引起人的感染，因此经其重配产生的毒株不容忽视。该毒株的发现为禽流感病毒的防控提供了新的素材。

 

 

2016年6月19日Nature出版集团《ScientificReport》杂志发表的题为“IntranasalAdministrationofChitosanAgainstInfluenzaA(H7N9)VirusInfectioninaMouseModel”报道了上海生物制品研究所首席科学家陈则关于H7N9流感预防新策略。陈则研究团队采用BALB/c小鼠作为动物模型，将粘膜免疫调节剂壳聚糖通过粘膜途径给药后，研究其对野生型H7N9亚型流感病毒的预防性效果。结果发现，壳聚糖经鼻给药小鼠后，能保护小鼠免受甲型H7N9流感病毒的攻击，且壳聚糖药物预防流感效果能持续至少10天左右。另外，进一步研究发现壳聚糖经鼻给药小鼠后，还能保护小鼠免受另外三种甲型流感病毒（PR8、2009H1N1和H9N2）的致死量攻击。研究表明：壳聚糖经鼻粘膜途径给药后，能通过诱导粘膜固有免疫提高小鼠对抗致死剂量流感病毒攻击的能力，并提供了一种预防流感病毒感染的新策略。

 

ChitosanaffordsprotectionagainstH7N9orPR8infectiona

 

 

7月28号CELL在线发表了由美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）、国家人类基因组研究所（NHGRI）和国立卫生研究院（NIH）的科学家们共同合作的成果：Vaccine-inducedantibodiesthatNeutralizeGroup1andGroup2InfluenzaAviruses.研究人员检查了六个接受抗H5N1流感（俗称禽流感病毒）疫苗的人的血液样本。在血液样本中他们鉴定了B细胞对流感病毒不同亚型的反应，然后对细胞的抗体基因序列进行特征化和分类,结果在多个参与者之间发现B细胞的编码三种类型的抗体可以中和广泛的流感病毒亚型。科学家们将所发现抗体和血凝素进行共结晶，结构分析显示：每种抗体都有特征性的基因，并将序列模块转换成血凝素主干可识别的重叠的原表位。这篇文章显示了现在可以运用B细胞测序的信息来快速和准确地预测参与者在未来流感疫苗试验中的免疫反应。作者们建议这些B细胞序列特征量化的普遍程度能作为一个指标来指导普通的流感免疫策略。

 

 

10月份，中国科学院微生物研究所高福研究组和李学兵课题组于JournalofMedicinalChemistry报道了一种新型具有高效抗流感活性的化合物TZ12。他们在仔细分析神经氨酸酶（NA）与扎那米韦的复合物晶体结构后，采用计算机辅助药物开发技术设计并合成了一系列的四价扎那米韦分子。其中化合物TZ12在随后的蛋白、细胞、小鼠水平的生物活性评价实验中表现出了对不同亚型的流感病毒株（包括耐药流感病毒株）表现出了较已有抗流感药物扎那米韦（zanamivir）更加优秀的抑制活性，有进一步进行临床前开发的潜力。另外，对感染了流感病毒的小鼠滴鼻给药一次TZ12就可以保护所有小鼠。另外，综合X晶体衍射实验、表面离子共振（SPR）实验、超速离心分析实验（AUC）和透射电镜实验（TEM）的研究结果表明TZ12的四个扎那米韦药效团可以同时进入到NA四聚体上的四个活性位点中，从而与NA四聚体形成热力学更加稳定的1：1复合物，从作用机制上解释了TZ12具有高效抗流感病毒活性的原因。这项研究的成果为其他多价抑制剂提供了更加合理有效的设计思路，而且也是对基于靶点蛋白结构进行药物设计的一个重要补充。

 

(A)TZ12的结构式及生物活性结果(B)TZ12与ShanghaiN9的复合物晶体结果(C)多次滴鼻给药的小鼠体重变化曲线(D)单次滴鼻给药的小鼠体重变化曲线(E)多次滴鼻给药的小鼠存活率曲线(F)单次滴鼻给药的小鼠存活率曲线

 

 

2016年12月2日，国际学术期刊NatureCommunications在线发表了上海巴斯德研究所孙兵组的最新研究进展（Humanantibody3E1targetstheHAstemregionofH1N1andH5N6influenzaAviruses），研究人员首先利用Octet系统检测3E1与不同亚型毒株血凝素相互作用的动力学参数，发现3E1与多株H1、H5亚型毒株的HA具有很高的亲和力，可以达到nM级别。体外中和实验表明3E1可以中和H1、H5亚型的多株毒株。体内小鼠实验显示，3mg/kg的3E1即可以对H1N1及H5N6起到完全的预防效果20mg/kg的3E1同时对H5N6感染后第三天依然有完全的治疗效果。结构解析表明，3E1通过其重、轻链靶定到血凝素的保守区域F-亚结构域,融合肽及外缘β折叠上，构成其识别表位，进一步抑制低pH诱导的血凝素构象变化，从而抑制病毒包膜与宿主细胞膜融合，控制了病毒的入侵。该研究结果是与上海生化细胞研究所蛋白质中心丁建平组及哈尔滨兽医研究所陈化兰组合作的成果。为开发新型抗流感病毒药物及基于流感血凝素结构的通用流感疫苗设计提供了新思路。

 

说明：3E1通过其重、轻链靶定到血凝素杆部区的保守表位,从而中和H1及H5亚型的多株流感病毒。（a）3E1与H1、H5、H3亚型的多株流感病毒血凝素具有高亲和力（b）3E1可以中和H1、H5、H3亚型的多株流感病毒（c）3E1通过其重、轻链靶定到血凝素的杆部区域。（d）3E1识别血凝素杆部区的保守表位：F-亚结构域,、融合肽及外缘β折叠

 

 

2016年12月2日国际顶级期刊《Science》发表了北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室周德敏/张礼和研究团队的突破性研究进展，题为“GenerationofInfluenzaAVirusesasLivebutReplication-IncompetentVirusVaccines”。这种疫苗能激活机体的全部免疫原性，而且不能在健康细胞中复制。“这一发现颠覆了病毒疫苗研发的理念，成就了活病毒疫苗的重大突破”。

 

他们对人胚肾（HEK）293T细胞进行了改造，利用慢病毒载体转染一种来自原核生物的正交翻译系统，改造后的293T细胞系用于流感病毒的包装。继而通过对流感病毒基因组进行定点突变人工插入终止密码，产生一种所谓PTC（prematureterminationcodon）病毒，这种病毒仍可以正常增殖并出现CPE，利用这种方法对所有8个基因进行突变分析，观察子代病毒的感染力与稳定性。课题组最终选择了一个PTC-4A病毒研究其安全性、免疫原性以及保护效果，PTC-4A病毒的突变没有涉及HA与NA基因，而涉及到PA、PB1、PB2与NP。他们的研究结果堪称完美，首先，PTC-4A病毒是高度减毒的，即使在109PFU病毒剂量下，实验小鼠仍存活，高于流感病毒野毒株LD50的10万倍；其次，该病毒可以诱导全面的适应性免疫应答，包括高效价的血凝抑制抗体（HI）、中和抗体（NT）与SIgA，此外病毒特异性CTLs数量高于传统疫苗的10倍。最后，这种候选疫苗病毒的免疫保护效果与现行减毒活疫苗类似，甚至优于后者，另外不同血清型流感病毒显示有交叉保护作用。

 

继而通过对流感病毒基因组进行定点突变人工插入终止密码，产生一种所谓PTC（prematureterminationcodon）病毒，这种病毒仍可以正常增殖并出现CPE，利用这种方法对所有8个基因进行突变分析，观察子代病毒的感染力与稳定性。课题组最终选择了一个PTC-4A病毒研究其安全性、免疫原性以及保护效果，PTC-4A病毒的突变没有涉及HA与NA基因，而涉及到PA、PB1、PB2与NP。他们的研究结果堪称完美，首先，PTC-4A病毒是高度减毒的，即使在109PFU病毒剂量下，实验小鼠仍存活，高于流感病毒野毒株LD50的10万倍；其次，该病毒可以诱导全面的适应性免疫应答，包括高效价的血凝抑制抗体（HI）、中和抗体（NT）与SIgA，此外病毒特异性CTLs数量高于传统疫苗的10倍。最后，这种候选疫苗病毒的免疫保护效果与现行减毒活疫苗类似，甚至优于后者，另外不同血清型流感病毒显示有交叉保护作用。

 

“这是一项‘四两拨千斤’的技术，仅使病毒基因组上万个碱基中的三个发生突变。它不仅使疫苗研发不再复杂，还适用于几乎所有病毒。”周教授说。

 

 

12月5日刊登在《美国国家科学院院刊》上的新研究中，美国威斯康星大学YoshihiroKawaoka教授领导的研究团队已经开发出一种可以提高乙型流感病毒疫苗产量的技术。这将能帮助开发更有效的疫苗，以保护人们免受流感感染，有助于在未来控制流行性感冒.

 

用于制作疫苗的流感病毒通常包含由6个不变基因和两个可变基因组成的“主干”，这些基因能编码流感病毒的表面蛋白。流感病毒表面蛋白刺激机体产生相应的抗体。为了开发新的乙型流感病毒“主干”，Kawaoka团队随机突变了乙型流感病毒主干中的基因，利用不同类型的表面蛋白对其进行测试并筛选乙型流感病毒的随机基因突变。以这些突变体作为模板，研究人员还融合了编码HA（血凝素）和NA（神经氨酸酶）的基因，这两种表面蛋白均引起免疫反应。最终鉴定出了两个能够在哺乳动物细胞中高产的乙型流感病毒“主干。新的乙型流感病毒“主干”能加速病毒在哺乳动物细胞内的生长速度。并能避免在鸡胚中生产产生的突变，这种突变会影响疫苗的有效性。“主干”将有助于简化每年的疫苗生产，这在流感疫情中尤其有意义。

 

Developmentofhigh-yieldinfluenzaBvirusvaccineviruses.