桂芍镇痫片主要成份有桂枝、白芍、党参、半夏(制)、柴胡、黄芩、甘草、生姜、大枣。那么，桂芍镇痫片的含量怎么测定呢？

原质量标准中只有黄芩、白芍的鉴别,无含量测定。为了好地控制本品质量,本试验对其质量标准进行了研究。采用薄层色谱(TLC)法对制剂中的甘草、党参及柴胡进行了鉴别,采用液相色谱(HPLC)法对制剂中君药白芍的主要成分芍药苷进行了含量测定。

1仪器与试药

LC-20AT液相色谱仪,包括SPD-20A检测器、Labsolution色谱数据处理工作站(日本岛津)；赛多利斯电子天平(1/100000,德国)；KQ-250DE数控型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

甘草次酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号110723-200411)；党参对照药材(供鉴别用,中国药品生物制品检定所,批号121057-200303)；柴胡对照药材(供鉴别用,中国药品生物制品检定所,批号120992-0301)；芍药苷对照品(供含量测定用,中国药品生物制品检定所,批号110736-200423)；桂芍镇痫片样品(自制,批号060811、060812、060813)。乙腈为色谱纯,水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。

2定性鉴别

2.1甘草的鉴别

取本品10片,除去薄膜衣,研细,称取细粉3g,加氯仿40mL,回流提取30min,滤过,滤渣挥干溶剂,加甲醇40mL,回流提取1h,滤过,滤液蒸干,残渣加水30mL使溶解,用水饱和的正丁醇提取3次,每次20mL,合并正丁醇液,用正丁醇饱和的水洗涤2次,每次20mL,合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为供试品溶液。另取甘草次酸对照品,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[《中华人民共和国药典》2005年版(一部)附录ⅥB]试验,吸取供试品溶液5～10μL、对照品溶液4μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(30～60℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(10∶20∶7∶0.5)为展开剂[1],展开,取出,晾干,喷以10%磷钼酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。

2.2党参的鉴别

取本品10片,除去薄膜衣,研细,称取细粉3g,加正丁醇50mL,超声处理30min,滤过,滤液浓缩至约0.5mL,作为供试品溶液。另取党参对照药材2g,加水20mL,微沸煮40min,滤过,滤液用正丁醇30mL振摇提取,正丁醇液浓缩至1mL,作为对照药材溶液。照薄层色谱法[《中华人民共和国药典》2005年版(一部)附录ⅥB]试验,吸取供试品溶液和对照药材溶液各5μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-无水乙醇-水(15∶3∶2)为展开剂[2],展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇,于105℃下加热。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。

2.3柴胡的鉴别

取本品10片,除去薄膜衣,研细,称取细粉3g,置具塞锥形瓶中,加甲醇50mL,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30mL使溶解,并转移到分液漏斗中,用水饱和的正丁醇提取3次,每次40mL,合并正丁醇液,用氨试液40mL洗涤,弃去氨液,正丁醇层蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为供试品溶液。取柴胡对照药材1g,加水微沸30min,滤过,滤液浓缩至约30mL,转移至分液漏斗中,余项操作同供试品,即得对照药材溶液。照薄层色谱法[《中华人民共和国药典》2005年版(一部)附录ⅥB]试验,吸取供试品溶液和对照药材溶液各10μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)为展开剂[3],展开,取出,晾干,喷以10%磷钼酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。

3含量测定

3.1色谱条件与系统适用性

色谱柱为DiamonsilTMC18(5μm,200mm×4.6mm)；流动相为乙腈-0.1%醋酸溶液(15∶85),流速为1.0mL/min；检测波长为230nm；柱温为室温。理论板数按芍药苷峰计算应不低于4000；分离度R＞1.5。

3.2溶液的制备

3.2.1对照品溶液

精密称取芍药苷对照品12.26mg,置100mL量瓶中,加甲醇适量使溶解,定容,摇匀,精密量取5.0mL,置10mL量瓶中,加甲醇定容,摇匀,经0.45μm滤膜滤过,即得。

3.2.2供试品溶液

取桂芍镇痫片10片,除去薄膜衣,研细,取细粉0.2g,精密称定,置50mL量瓶中,加稀乙醇35mL,超声处理((功率250W,频率40kHz),放冷,加稀乙醇定容,摇匀,滤过,取续滤液,经0.45μm滤膜滤过,即得。

3.2.3阴性对照品溶液

按处方组成及制备工艺制备不含芍药的样品,按“3.2.2”项下方法处理,即得。

3.3空白干扰试验

按上述色谱条件,分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液,注入液相色谱仪,测定。结果在供试品色谱中,在与对照品色谱峰相应的位置上有相同保留时间的色谱峰,而阴性对照品溶液在此无峰,见图1。芍药苷与其他组分分离良好,说明阴性样品对芍药苷含量测定无干扰。

3.4线性范围考察

精密吸取对照品溶液4.0、6.0、8.0、10.0、12.0μL,按上述色谱条件测定,记录色谱图,以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标,进行线性回归,得回归方程为：Y＝1547954X＋14289(r＝0.9997)。结果表明,芍药苷在0.2452～0.7356μg范围内线性关系良好。

3.5精密度试验

精密吸取对照品溶液10μL,按上述色谱条件重复进样5次,记录色谱图,计算。结果RSD＝0.81%,表明本法精密度较好。

3.6稳定性试验

精密吸取供试品溶液10μL,按上述色谱条件测定,分别于0、4、8、12、24h进样,记录色谱图,测定峰面积,计算。结果RSD＝1.04%,表明供试品溶液在24h内基本稳定。

3.7重复性试验

取同一批样品(批号060811)5份,按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件测定,记录色谱图,测定峰面积,计算。结果本品平均含量为13.06mg/g(RSD＝1.10%),表明本方法重复性良好。

3.8加样回收率试验

取已知含量的样品(批号060811,含量13.06mg/g),除去薄膜衣,研细,取0.1g,精密称定,置50mL量瓶中,精密加入芍药苷对照品溶液10mL(浓度为0.1226mg/mL),其余按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件测定,记录色谱图,计算,结果见表1。本方法回收率在96.7%～100.3%之间,RSD＝1.52%,表明方法的准确性较好。

3.9样品测定

取3个批号(060811、060812、060813)的样品,平行2份,按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液。精密量取对照品、供试品溶液各10μL,按上述色谱条件测定,测定峰面积,计算。结果3个批号样品中芍药苷的平均含量分别为4.12、4.09、4.08mg/片。

4讨论

曾试验了甲醇-0.1%磷酸溶液(35∶65)、甲醇-水(30∶70)及乙腈-0.1%醋酸溶液(25∶75)等流动相系统,结果均不理想。而流动相为乙腈-0.1%醋酸溶液(15∶85)时,具有较好的分离度和适宜的保留时间,故以此作为含量测定的流动相。

在筛选样品中芍药苷的提取条件时,比较了稀乙醇加热回流法和超声提取法,结果超声提取方便、迅速,超声30min即可提取完全,故样品的处理采用超声提取30min。

以TLC法对制剂中的甘草、党参及柴胡进行定性鉴别,斑点清晰,专属性好,无阴性干扰。芍药苷为白芍中的主要成分,可用来作为中成药中白芍的定量指标成分。所建立的HPLC法测定芍药苷含量简便、重复性好,可作为控制本品质量的指标。

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（实习编辑：陈广海）

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