外显子组测序技术对疑似鱼鳞病患儿进行分子诊断的方法学研究

　　外显子组测序是利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法，对常见和罕见变异有高灵敏度。余蕾等利用外显子组测序技术对1例疑似鱼鳞病患儿进行了分子诊断，并探讨其作为临床难诊断疾病的辅助诊疗手段的可能性。

　　患儿男，出生于2013年8月1日（剖宫产出生，其母产前5d入院检查持续尿蛋白+++，血清白蛋白较低，输血浆不能纠正），体重2.4kg，发育基本正常，全身皮肤硬，无弹性，火红焦化状脱皮；头发呈卷曲碾碎感。显微镜下见头发呈竹节状，临床诊断为火棉胶婴儿。除此症状之外，无其他异常，从外观上看怀疑为鱼鳞病。染色体和染色体微缺失检查正常。父母体健，否认近亲结婚，家族中未见类似患儿。

　　对不明病因患儿的外显子组测序的流程包括样品收集及DNA提取，文库制备和目标基因筛选，测序及数据分析3个模块。对该患儿的外显子组测序共发现了172639个SNP位点，20434个插入/缺失位点，其中新的SNP位点为18825个，新的Indels为6890个。通过对这些突变位点进行致病性分析以及可能导致疾病的推测，共发现19个可能的致病突变，其中位于第5条染色体上的SPINK5基因的第5外显子保守区序列位点发生了非同义突变c.318G>A，导致了氨基酸的改变Asp-Asn，从而可能引起内瑟顿综合征的发生。

　　内瑟顿综合征的临床特征为鱼鳞病样红皮病、发干异常和特应性素质，出生时即出现红斑，这些症状与本研究的患儿临床症状类似。将临床症状结合基因检测结果，初步确定该患儿为携带SPINK5基因杂合突变G318A的内瑟顿综合征患者。经过PCR扩增，得到了380bp的目的片段，对目的片段进行回收、纯化、一代测序，结果显示，该患儿的SPINK5基因确实存在G318A的杂合突变。

　　本研究针对1例临床上无法准确判断其病症的疑似鱼鳞病患儿，采用外显子组测序技术，对患儿的血液样本进行目标基因筛选、高通量测序及数据分析。外显子组测序技术的难点在于探针的设计，要求探针设计在维持专一性的同时，能有效捕获携带突变的片段。本文采用的是很多探针位置交错，大量起始点不同的探针去杂交捕获，可以高效地捕获发生变异的目标基因片段，定制过程中我们充分考虑了探针的密度和数量，并对杂交条件进行优化，最大可能发现更多的基因变异信息。