体外鉴定衣原体质粒侵袭细胞相关毒力基因

　　沙眼衣原体鼠肺炎株（MoPn）也称为鼠肺炎衣原体，经证实不仅可以感染小鼠的生殖道，而且还可引起输卵管的病变，与女性泌尿生殖道Ct感染后的疾病发展过程一致。目前运用基因重组技术已成功构建重组质粒pGFP::CM，并成功转化了质粒缺失株CMUT3。Pgp1，2，6，8是维持质粒基本结构的因子，故目前只成功敲除了Pgp3、4、5、7并构建各转化菌株。转化成功的菌株命名为pGFP::CMΔPgp3、pGFP::CMΔPgp4、pGFP::CMΔPgp5、pGFP::CMΔPgp7。

　　目的比较几种转化沙眼衣原体鼠肺炎株（MoPn）对宿主细胞的感染力，鉴定与衣原体质粒侵袭细胞相关的毒力基因。

　　方法培养携带敲除了不同开放阅读框架（ORF）质粒的转化菌株，并不断扩增收集。测定浓度后，以相同菌量接种并按离心+二乙胺乙基葡聚糖（DEAE）、离心、DEAE、无任何处理4个条件分别对菌株进行处理，采用间接免疫荧光法计数包涵体数目；分别于（20、40、60h）观察各菌株连续3代感染细胞后菌斑形成速度与面积。用Lugol碘染色观察各菌株包涵体内糖原合成情况。

　　结果敲除质粒编码蛋白Pgp4的菌株pGFP::CMΔPgp4在4种条件下包涵体数目分别为（10.20±1.30）、（6.80±0.44）、（3.00±1.22）、（0.80±0.45）个，阴性对照组质粒缺失株CMUT3包涵体数目分别为（6.40±0.89）、（3.80±0.83）、（1.60±0.89）、（0.60±0.54）个，同一条件下两者均表现出相近的感染力，包涵体数目均低于同一条件下其他菌株（均P<0.01）。同一菌株不同条件下，包涵体数目差异有统计学意义（F=845.310，P<0.01），各菌株在离心+DEAE条件下包涵体数目最多；连续3代感染细胞时菌斑形成速度和大小均低于其他菌株；并有糖原累积的障碍。

　　结论Pgp4是衣原体质粒侵袭细胞相关的毒力基因之一。

　　讨论

　　Pgp4是质粒编码的开放阅读框中最小的片段，编码102个氨基酸，质粒编码的许多基因的表达都依赖于Pgp4，无论是在沙眼衣原体或者鼠型沙眼衣原体感染中，均已证实Pgp4是一个正转录调节因子。质粒缺失株CMUT3和Pgp4敲除的菌株免疫荧光显微镜下计数包涵体数目均明显低于其他菌株，提示两菌株对宿主细胞的感染能力低于其他菌株。碘染时两菌株均出现包涵体内糖原染色障碍，提示Pgp4是与毒力基因密切相关的转录调节因子并影响包涵体内糖原的合成。两菌株的菌斑形成速度与面积均低于其他菌株，提示毒力基因Pgp4影响衣原体在细胞与细胞之间传播的能力，可为动物实验鉴定影响衣原体上行感染能力的毒力基因提供基础。