过表达NF-E2相关因子2对白癜风黑素细胞PIG3V线粒体生物合成和功能的影响

　　目的探讨过表达NF-E2相关因子2（Nrf2）对黑素细胞线粒体合成和功能的影响。

　　方法构建含有人Nrf2基因全长的过表达质粒Nrf2-pEX-1，用该质粒瞬时转染白癜风患者表皮黑素细胞系（PIG3V）。实验分为空白组（不含质粒）、对照组（转染pEX-1空质粒）、过表达组（转染pEX-1-Nrf2过表达质粒）。过表达Nrf2后，RT-PCR和Western印迹法检测PIG3V线粒体生物合成相关的Nrf2、核呼吸因子1（NRF1）、线粒体转录因子A（TFAM）mRNA和蛋白水平的变化；RT-PCR检测线粒体DNA（mtDNA）拷贝数。流式细胞仪检测线粒体膜电位（MMP）；荧光素酶报告系统检测细胞ATP含量。采用两样本t检验进行统计学分析。

　　结果Nrf2过表达质粒转染PIG3V细胞后24h，Nrf2mRNA、NRF1mRNA水平较对照组明显升高，差异有统计学意义（均P<0.001），而TFAMmRNA水平与对照组比较差异无统计学意义；48h后Nrf2mRNA、TFAMmRNA水平较对照组升高，差异均有统计学意义（P<0.05），而NRF1mRNA水平与对照组差异无统计学意义。Western印迹法显示，转染后24h，过表达组Nrf2、NRF1、TFAM蛋白表达与对照组比较差异均无统计学意义，48h后过表达组Nrf2、NRF1、TFAM蛋白表达升高（P<0.05）。过表达组MMP在转染24h后较对照组升高2.313%（t=5.546，P=0.005），48h后升高14.872%（t=8.537，P=0.001）。线粒体合成指标相对mtDNA拷贝数，在转染24h后两组间差异无统计学意义（P>0.05），48h后过表达组明显高于对照组（t=5.760，P=0.005）；细胞ATP含量在转染后24h两组间差异无统计学意义（P>0.05），48h后过表达组ATP含量较对照组明显升高（t=22.040，P=0.008）。

　　结论过表达Nrf2可以促进黑素细胞线粒体生物合成相关基因和蛋白的表达，进而促进线粒体生物合成，上调线粒体功能相关的指标。

　　讨论

　　本研究中，白癜风患者黑素细胞过表达Nrf2后，MMP升高，细胞内ATP含量增加。而且，在转染Nrf2过表达质粒后24h，NRF1mRNA即明显升高，而TFAMmRNA无明显变化；在48h后NRF1mRNA降至正常水平时，TFAMmRNA却明显升高。TFAMmRNA升高滞后于NRF1mRNA升高的现象，提示NRF1是作为上游基因调控TFAM的升高，与小鼠肝脏细胞、心肌细胞内的研究结果一致。

　　Nrf2通路是细胞内抗氧化应激的主要通路。磷酸化的Nrf2发生核转位，可与抗氧化反应元件如NRF1相结合，促进一系列的抗氧化基因的表达。NRF1上调后进一步促进TFAM表达，进而使线粒体生物合成增加，功能障碍改善。作为细胞内作用广泛的转录因子，Nrf2保护黑素细胞的机制可能不仅限于此。通过本实验我们证实，在白癜风黑素细胞中Nrf2改善线粒体功能，间接抑制线粒体凋亡途径，可能是其抗氧化应激作用的另一重要机制。