miR-145对人角质形成细胞系HaCaT细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

　　目的研究miR-145对人角质形成细胞系HaCaT细胞增殖、细胞周期及凋亡的调控效应。

　　方法化学合成miR-145的模拟物，采用瞬时转染的方法过表达miR-145。采用实时PCR方法检测miR-145的表达。MTS方法检测过表达miR-145对HaCaT细胞增殖的影响。流式细胞仪分析过表达miR-145对细胞周期及凋亡的影响。采用荧光素酶实验，实时PCR和Western印迹鉴定NRAS是否为miR-145的靶基因。

　　结果与阴性对照（NC）mimics转染组相比，miR-145mimics转染组miR-145表达水平上调（85.00&plusmn;1.21）倍，两组差异有统计学意义（t=115.90，P<0.001）。转染miR-145mimics有抑制HaCaT细胞的增殖作用（F=8.76，P=0.008）；转染后的时间因素（24、48、72、96h）对细胞有影响（F=17.85，P<0.001），转染mimics和培养时间之间不存在交互作用（F=1.21，P=0.18）。与NCmimics转染组相比，miR-145mimics转染组的早期凋亡、晚期凋亡细胞比例均明显增加，差异有统计学意义（18.9%±4.1%比4.3%±1.2%，t=7.126，P<0.01；9.3%±2.3%比3.6%±1.6%，t=12.38，P<0.01）。与NCmimics转染组相比，miR-145mimics转染组HaCaT细胞的G2及S期细胞比例均明显降低，差异均有统计学意义（6.26%±1.2%比19.36%±3.45%，t=7.610，P=0.017；7.91%±1.3%比18.56%±5.23%，t=7.230，P=0.019），而处于G1期的细胞比例升高，差异也有统计学意义（85.83%±5.2%比62.08%±6.23%，t=11.78，P=0.007）。与NCmimics联合psi-CHECK2-NRAS-wild组相比，在293T细胞中共转染miR-145mimics和psi-CHECK2-NRAS-wild质粒，其荧光素酶值明显下降，miR-145可抑制含NRASmRNA3′UTR报告基因的荧光素酶表达（t=11.09，P=0.008）；而将NRASmRNA3′UTR报告基因上miR-145的结合位点进行突变后，转染miR-145mimics对含NRASmRNA3′UTR报告基因的荧光素酶表达无明显的影响（P>0.05）。实时PCR和Western印迹结果表明，过表达miR-145mimics后，NRASmRNA表达水平未出现明显变化（P>0.05），对NRAS蛋白水平的表达有明显的抑制（1.52±0.07比0.20±0.02，t=28.43，P<0.01）。

　　结论miR-145可能通过NRAS影响HaCaT细胞的周期从而抑制细胞的增殖，同时促进HaCaT细胞的凋亡。

　　讨论

　　本研究表明miR-145可以抑制HaCaT细胞增殖，而且过表达miR-145可以明显抑制细胞从G1到S期的过渡，使处于S期的细胞数量明显减少。提示miR-145可能通过影响细胞周期的方式影响HaCaT细胞的增殖。另外，miR-145还可以促进细胞凋亡。由于细胞周期和细胞增殖、凋亡属于不同的信号通路调控，推测miR-145的靶基因应该不止一个。

　　hsa-mir-145靶基因信号通路富集分析发现，miR-145可能参与MAPK信号通路的调节，其中，NRAS是MAPK信号通路的关键基因。本研究证明，NRAS是miR-145的靶基因，且miR-145可以通过影响NRAS翻译的方式影响NRAS蛋白水平的表达。提示我们miR-145可能通过影响NRAS的表达从而影响MAPK信号。