血卟啉光动力作用杀伤人胆管癌细胞的实验研究

 

　　温子龙薛平卢海武胡以则

 

　　【摘要】目的研究血卟啉化衍生物(hematoporphyrinderivative，HPD)光动力作用【photodynamictherapy,PDT)对人胆管癌细胞QBC939的杀伤效应：方法以人胆管癌细胞系QBC939为研究对象，采用血卟啉化合物作为光敏剂，半导体激光治疗仪为光源。实验分为对照组(空白对照组、单纯光动力组、单纯光敏剂组)和光动力作用组，以系列浓度的血卟啉经不同强度光照后，用MTT法测定PDTX~QBC939细胞的相对抑制率和筛选最佳PDT参数。结果光动力作用组的吸光度(OD值)与对照组间的差异具有统计学意义(P<0.01)，随着HPD浓度的增加和光照强度的增大，光动力作用对细胞的相对抑制率逐渐增大。不同的光敏剂浓度和光照强度间组合能达到相同的抑制率，如以10mg／LHPD经5J／c㎡fl~照强度或以4mg／L．HPD经15J／c㎡光照强度XCQBC939均可以达到92％相对抑制率。在最佳光照能量密度条件下，设计三组功率一时问组合，组间没有显著差异。

 

　　结论

 

　　1)PDTX~人胆管癌细胞QBC939具有明确的杀伤作用，其对细胞的抑制率具有显著的剂量效应关系。光敏剂浓度和光照强度间存在交互关系，从临床角度考虑，采用较低的光敏剂浓度经较大的光照强度照射是理想的PDT治疗方案。

 

　　2)改变功率时间的组合不会影响光动力对胆管癌细胞杀伤作用，采用在光纤承受范围内的大功率短时间的照射方式可达到安全快捷的目的。

 

　　【关键词】血卟啉衍生物；光动力疗法；胆管癌

 

　　胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤。由于其解剖位置的特殊性，早期诊断困难，手术根治切除率低，而且对放疗或化疗不敏感。随着光动力疗法(PDT)与内镜技术的结合，光动力疗法成为中晚期胆管癌重要辅助治疗手段。较多的基础研究阐明了有关PDT杀伤肿瘤细胞机理，但国内外鲜有对胆管癌进行细胞或动物实验研究。本实验研究以人胆管癌细胞QBC939为研究对象，MTT法探讨血卟啉光动力作用对体外培养的人胆管癌细胞的杀伤效应，选择最佳的PDT作用参数，为临床提供安全有效的PDT治疗方案。

 

　　材料与方法一、试剂和仪器QBC939人胆管癌细胞系，由湖南湘雅医学院细胞实验室提供。血卟啉衍生物针剂为重庆华鼎现代生物制药公司产品，避光保存愈于4℃冰箱。采用半导体激光治疗仪为光源，其输出功率为2W，波长630nm，光纤最大承受功率为800mw。

 

　　二、细胞培养和HPD孵育QBC939置于含lO％小牛血清的RPIM1640培养液中，37℃，5％C02条件下培养箱中培养，细胞呈上皮样贴壁生长。选择对数生长期良好的QBC939，用0．25％胰酶消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后稀释成2×10?／ml，以每孔200ul接种于96孔板中。光动力组分6组，每组3复孔，并设空白对照组、单纯光敏剂组(未经光动力照射，只是加入系列浓度的光敏处理的QBC939)、单纯光照组(未经HPD处理的QBC939)作对照。培养24h，光动力组和单纯光敏剂组加入不同浓度HPD(终浓度分别为4、6、8、10、12、14mg／L，共6个不同浓度)继续培养24h。

 

　　三、光动力照射和OD值测定第2天光动力组和单纯光照组接受光动力照射，距离为1.5cm，光斑面积3c㎡。为光照方便，每板只接受同一光剂量的照射，设以下3种光照剂量：5、l0、15J／cm。照射结束后，换新培养液培养48h。0．5％MTT每孔20l，并加入新鲜培养液稀释至200ul，7℃孵育4h，弃尽培养液，加入DMSO150ul，置微量震荡器上振荡5min。将上述96孔板送人酶标仪测定吸光度(OD值)入=570nm，记录整理好实验数据。根据公式相对抑制率=耐照组OD值一实验组OD值)／对照组OD值×100％，得出生长相对抑制率。参照MTT法的相对抑制率的评价，>50％为敏感，30％～50％为中度敏感，<30％为耐药1

 

　　四、筛选PDT最佳作用参数绘制不同光照剂量PDT对细胞生长相对抑制率的3条曲线，选择最佳的PDT作用参数，并设计3种不同功率一时间组合，采用MTT法测定OD值。

 

　　五、统计学处理

 

　　所有数据均以X&plusmn;S表示，使用SPSS10.0统计软件进行单向方差分析。

 

　　结果

 

　　一、MTT法测定PDT对胆管癌细胞的杀伤效应实验组OD值均比对照组低，从4mg／L，5J／c㎡开始，OD值与单纯光照组相比差异具有显著性意义(P<O．O1)。而从6mg／L，5J／c㎡开始，与单纯光敏剂组相比OD值差异亦具有统计学意义(P<0．01)。

 

　　单纯光照组在接受不同剂量光照后，组间的OD值没有显著差异。同样，单纯光敏剂组在加入不同浓度光敏剂后

 

　　组间的OD值也没有显著差异(表1)。

 

　　二、光敏剂浓度和光照强度对QBC939相对抑制率的影响低光动力剂量5J／cm2，4mg／L光敏剂浓度开始，相对抑制率已经达到53．68％的治疗敏感标准，并且PDT对胆管癌细胞的杀伤效应随HPD浓度的增加和光剂量的增大而升高，在低光动力剂量5J／cm2下，只需稍增加光敏剂浓度，相对抑制率上升迅速，由最低有效浓度53．68％(4mg／L)提高到81．05％f6mg／L)、91.07％(10mg／L)，之后达到平台，即使再增加光敏剂浓度，相对抑制率也没有显著变化。此外，对QBC939细胞，不同的光敏剂浓度和光照强度间组合能达到相同的抑制率，以10mg／LHPD经5J／cm光照强度(A点)或以4mg／LHPD经15J／am2光照强度(B点)均可以达到92％抑制率(图1)。

 

　　三、功率一时间组合由图1筛选出6mg／L光敏剂浓度，10J／am光照能量密度(C点)为本实验最佳PDT作用参数，根据W=P×T公式，设计三组功率一时间组合

 

　　50mW一10min、100mW一5min、200mW一25min。MTr法测定OD值，绷0为0．0654±0．0190、0.0709±0．0140、0．0568±0．0090，统计学分析(SNK法，P=1．0)没有显著差异。

 

　　讨论

 

　　动力疗法是肿瘤治疗领域中的一项新技术，具有创伤小，对肿瘤特异性高的特点。随者激光医学、光纤和内镜技术发展，PDT治疗胆管癌取得良好的临床疗效，成为近年倍受关注的一项新进展。Ortner以及Zoepf等1报告内镜引导下PDT治疗不能手术的晚期胆管癌病人，在解除黄疸，改善病人生活质量取得较好的效果。

 

　　光动力疗法杀伤肿瘤细胞的机制是利用肿瘤组织能较多摄取光敏剂，在特定波长激光(630nm)照射下，吸收光子的能量并将能量传递给氧，生成具有亲电性并能高效氧化生物大分子的单线态氧，引起脂质过氧化酶的失活和蛋白质的变性，交联以至结构的改变，从而破坏细胞的结构和功能以及肿瘤组织微血管。陈祖林等H报道大肠癌细胞经PDT后超微结构显示线粒体、质膜、内质网损伤尤其严重，癌细胞内空泡多，线粒体肿胀、脊断裂，染色质溶解、消失，胞器严重变性。

 

　　较多的基础研究从理论上阐明了有关PDT杀伤肿瘤细胞机理，当中的报道与文献主要集中体表皮肤肿瘤和腔道肿瘤，如食管癌、支气管肺癌、膀胱癌。在实体肿瘤如胰腺癌、肝癌方面，也有不少的文献报道，但目前国内外鲜有对PDT杀伤胆管癌细胞的基础研究报道。本实验以人胆管癌细胞系QBC939为研究对象，用MTr法测定以系列浓度的血卟啉经不同强度光照后对QBC939的相对抑制率，研究PDT对人胆管癌细胞的杀伤作用。实验组在低光敏剂4mg／L，

 

　　，5J／c㎡低光照强度组合中，相对抑制率已经达到了53．68％，与谢晓东等报道的Mrrr法原代癌细胞药敏试验结论相近圈，说明QBC939对血卟啉光动力治疗敏感。同时本次实验发现单纯光照组、单纯光敏剂组问的OD值没有显著差异，说明光敏剂和特定波长的光照是光动力杀伤肿瘤细胞作用中缺一不可的重要因素。

 

　　目前光动力疗法常用的计量参数主要是：光敏剂浓度、光照强度、以及给药和光照的间隔时问等。

 

　　PDT的生物效应和其最终的临床疗效是由受照射的靶细胞或靶组织中的光敏剂的浓度、光量、分子氧含量以及靶细胞对PDT敏感性等多种因素决定的。如何选择最佳的光动力作用参数提高临床疗效成为研究热点。

 

　　本实验结果显示PDT对QBC939杀伤具有显著的剂量依赖性，为其抑制率随光敏剂的浓度的增加和光照强度增强而升高。在低光动力剂量下,抑制曲线上升迅速，后逐渐达平台期。此外还观察到光敏剂浓度和光照强度问存在交互关系，在一定范围内，为达到相同的抑制率，可选择提高光敏剂浓度经较小的光照强度组合或选择降低光敏剂浓度经较大的光照强度。赵玉沛等[61在大鼠实验性胰腺癌的光动力治疗研究中发现，随着组织中光敏剂浓度的升高和光照能量的增加，正常胰腺组织可见水肿加重，十二指肠绒毛上皮亦被完全破坏及肝细胞坏死等改变，同时我们关于光动力治疗人胆管癌细胞荷瘤裸鼠的实验研究中发现高光敏剂浓度会引起严重的光敏毒性反应。从临床角度出发，采用较低的光敏剂浓度，经较大光剂量照射可能是比较理想的PDT作用参数。光照强度常以能量密度(J／em)表示，根据能量公式W=PXT可以看出能量大小受光照功率和照射时问影响。本次实验采用6mg／L，10J／c㎡为最佳作用参数，发现不管采用何种功率一时间组合效果都没有明显差异。从临床角度出发采用在光纤承受范围内的大功率短时间的照射方式(200mW一2．5min)，可达到安全快捷的目的。

 

　　我们采用MTT法测定相对抑制率证实了血卟啉光动力作用对QBC939胆管癌细胞具有明显杀伤作用，并筛选出PDT的理想作用参数，为临床制定安全有效的光动力疗法方案提供重要的指导意义。