【基础研究】长链非编码RNA-Co7Rik的表达特征及其对糖异生的影响

　　目的

　　揭示长链非编码RNA(longnon-codingRNA，LncRNA)Co7Rik的表达特征及其在肝脏糖异生中的潜在作用。

　　方法

　　建立饥饿-再进食动物模型、高脂饮食诱导的肥胖模型，qPCR法检测LncRNA-Co7Rik表达变化；分离C57BL/6J小鼠不同部位组织，检测其组织表达规律。原代分离小鼠肝脏原代细胞，分别给予二丁酰环腺苷酸(db-cAMP)、Forskolin、地塞米松、Hydrocortisone等药物刺激，揭示生糖信号对LncRNA-Co7Rik表达的影响。采用核质分离法检测LncRNA-Co7Rik在细胞核/细胞质中的分布特征，进行亚细胞定位。

　　结果

　　动物模型研究显示LncRNA-Co7Rik在饥饿0h、2h、5h、16h及再进食20h的表达量分别为1.00&plusmn;0.61、2.98±0.87、3.41±0.98、6.73±1.21、1.53±0.78(均P<0.05)，表明LncRNA-Co7Rik的表达水平随饥饿进程显著升高，在再进食后恢复正常水平。且与正常对照组相比，高脂饮食诱导的肥胖小鼠肝脏中LncRNA-Co7Rik的表达明显上调(1.00±0.21对2.92±0.63,P<0.01)。不同组织定量表明LncRNA-Co7Rik在肝脏组织中特异性表达，表达量是其他组织的3～4倍(P<0.05)；体外研究发现，LncRNA-Co7Rik的表达受糖异生信号调控，提示其可能参与糖异生过程；亚细胞定位揭示LncRNA-Co7Rik主要分布于细胞核中，提示其可能在基因转录水平发挥作用。

　　结论

　　LncRNA-Co7Rik是一个受生糖信号调控的肝脏特异性长链非编码RNA，并可能参与糖异生生理、病理过程。

　　肝脏是维持葡萄糖代谢稳态的最重要器官。当机体葡萄糖供应充足时，肝脏可以将葡萄糖以肝糖原的形式储存起来；当机体葡萄糖供应不足时，肝脏可以通过增强糖异生使肝葡萄糖生成增加[1]。糖异生作用是指非糖物质如乳酸、丙酮酸、甘油、生糖氨基酸等，在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK)及葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)等相关酶的作用下生成葡萄糖或糖原的过程。近期研究发现，过度的糖异生是导致胰岛素抵抗、肥胖、2型糖尿病等疾病发生的关键[2]。LncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸，不编码蛋白的RNA。LncRNA可在转录与转录后水平调控基因表达，参与X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，与人类疾病(如肿瘤、心血管疾病、糖尿病等)的发生、发展和防治都有着密切的联系[3,4,5]。

　　已有研究证实LncRNA参与内分泌代谢性疾病的发生[6]。LncRNA-HI-LNC25可通过正向调节胰岛转录因子GLIS3的表达，引起β细胞功能障碍从而导致糖尿病的发生[7]。Liu等[8]发现LncRNA-SRA通过结合转录共激活子PPARγ，促进脂肪细胞的分化、增强分化后脂肪细胞的糖脂代谢能力；SRA基因敲除后可以预防肥胖发生并改善高脂饮食诱导的小鼠糖代谢异常。而目前关于LncRNA在肝脏糖、脂代谢中的研究报道较少。长链非编码RNA-4833411C07Rik(LncRNA-Co7Rik)是我们新发现的、随饥饿过程在肝脏组织中显著高表达的LncRNA(未发表资料)。本研究将进一步揭示LncRNA-Co7Rik的表达特征及其可能参与肝脏糖异生调节的作用，为胰岛素抵抗、肥胖、2型糖尿病等疾病的防治提供新的靶标。

　　材料和方法

　　一、材料

　　6～8周龄、雄性、SPF级、C57BL/6J小鼠，由南京大学模式动物研究所提供；4%的水合氯醛；50mmol/LEGTA；1mmol/LCaCl2；1mol/LHEPESS；480mmol/LKCl；120mmol/LMgSO4；120mmol/LKH2PO4；DMEM培养基，胎牛血清，双抗，Ⅳ型胶原酶；高脂饲料(ResearchDietsD1249260kcal%fat)；二丁酰环腺苷酸(db-cAMP)、地塞米松(dexamethasone)、Forskolin(腺苷酸环化酶激活剂)、氢化可的松(hydrocortisone)均购于德国Sigma公司；RNeasyminikit(德国Qiagen公司)；Trizol、TakaraPrimeScript?RTMasterMix(日本Takara公司)；PARIS?itProteinandRNAIsolationSystem、SYBRGreenPCRMasterMix(美国LifeTechnologies)。

　　二、方法

　　1．饥饿-再进食(fasting-feeding)循环模型：

　　选取SPF级别的6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠30只，适应1周后，随机分为5组(每组≥6只)，即正常饮食组、饥饿2h组、饥饿5h组、饥饿16h组以及再进食20h组[9]。

　　2．HFD小鼠模型：

　　选取SPF级别环境饲养的6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠12只，随机分为2组(每组≥6只)。即正常饮食组和高脂饮食组，持续喂养2个月后取小鼠的肝脏。

　　3．小鼠原代肝细胞的分离与培养：

　　用4%的水合氯醛麻醉小鼠，用剪刀剪开小鼠的腹腔，拨开肠管，显露门静脉和下腔静脉。将头皮针插入下腔静脉，灌注1～2ml的含HEPESS的灌注液，门静脉充盈后，剪开门静脉，继续灌注约50ml后改换含胶原酶的灌注液。待肝脏颜色变为土黄色后，摘取肝脏，剔除胆管，用剪刀除去肝脏包膜，剪碎组织。于100目的筛子过滤至50ml的离心管(4℃预冷)。加入20ml预冷的DMEM完培，于4℃离心500rpm5min。弃上清，再加入15ml预冷的DMEM完培，4℃，500rpm5min，反复3次。吸去培养液，加入10ml预冷培养液，用台盼蓝染色检测细胞活力后将细胞接种在六孔板中。

　　4．RNA的抽提及反转录：

　　(1)组织RNA的提取：分别取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、胰、胃、小肠、脑、骨骼肌、棕色脂肪和白色脂肪，每50～100mg加入700μlTrizol，经生物样品匀浆机(Bioprep-24Homogenizer)匀浆后抽提总RNA。使用AgilentBioanalyzer2100对RNA样品的质量、浓度及纯度进行测定。(2)细胞RNA的提取：移除培养基，PBS洗2遍，加入Trizol裂解细胞，按10cm2面积培养皿加700μl的Trizol，室温静置5min，加入140μl的氯仿，4℃12000×g离心15min后取上清，加入1.5倍的无水乙醇，然后使用RNeasymini试剂盒进行后续操作。(3)反转录：按TakaraPrimeScript?RTMasterMix的说明要求配置反应液，置于PCR反应仪，反应条件为：37℃15min；85℃5s；4℃。

　　5．核质分离：

　　按PARIS?KitProteinandRNAIsolationSystem试剂盒对小鼠肝原代细胞进行核质分离，用实时PCR检测LncRNA-Co7Rik的表达，核内RNA以45SrRNA为内参，细胞质以12SrRNA为内参。

　　6．引物设计：

　　根据生物信息学数据库(Ensembl)查找LncRNA-Co7Rik、PEPCK、G6Pase、45SrRNA、12SrRNA的正确序列，选择36B4为内参。采用Primer3在线软件设计引物，然后经美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI)对设计的引物进行特异性的验证，送公司合成(表1)。

　　7．实时PCR：

　　按照SYBRGreenPCRMasterMix进行实时PCR，每个样品设置3个重复。反应条件：95℃预变性10min、95℃变性15s、60℃退火15s、72℃延伸30s，共40个循环。

　　8．药物干预实验：

　　原代肝脏细胞生长至对数期时，分别给予1mmol/Ldb-cAMP、10μmol/LForskolin、1μmol/L地塞米松及1μmol/L氢化可的松刺激，于0h、3h、6h、12h、24h收集细胞，提取RNA，qPCR检测LncRNA-Co7Rik的表达情况。

　　三、统计学处理

　　采用SPSS19.0进行统计分析，数据以±s表达。采用t检验比较各组之间的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　结果

　　一、生理性糖异生信号激活小鼠肝脏中LncRNA-Co7Rik的表达

　　采用qPCR检测，正常喂养(饥饿0h)、饥饿(2h、5h、16h)及饥饿再进食(饥饿16h＋20h再进食)小鼠肝脏中LncRNA-Co7Rik的表达变化(图1)。将饥饿0h的表达量标化为1.00，LncRNA-Co7Rik在饥饿0h、2h、5h、16h及再进食20h的表达量分别为1.00±0.61、2.98±0.87、3.41±0.98、6.73±1.21、1.53±0.78(均P<0.05)，LncRNA-Co7Rik的表达水平随饥饿进程显著升高，在再进食后恢复正常水平，且差异有统计学意义。

　　二、LncRNA-Co7Rik的组织表达规律

　　选取SPF级6～7周龄C57BL/6雄性小鼠，取其BAT、WAT、心、肝、脾、肺、肾、小肠、脑、胃和骨骼肌，qPCR检测各个组织中LncRNA-Co7Rik的表达变化。结果显示LncRNA-Co7Rik在肝脏组织中特异性表达，表达量是其他组织的3～4倍(均P<0.05)，且差异具有统计学意义。

　　图2LncRNA-Co7Rik的组织特异性

　　Fig2TissuespecificityofLncRNA-Co7Rik

　　三、病理性糖异生信号激活小鼠肝脏中LncRNA-Co7Rik的表达

　　经qPCR检测，正常对照组小鼠和高脂饮食诱导的肥胖小鼠肝脏中LncRNA-Co7Rik的相对表达量分别为1.00±0.21和2.92±0.63(P<0.01)，LncRNA-Co7Rik在高脂饮食诱导的肥胖小鼠肝脏中的表达水平较正常对照组显著升高，且差异具有统计学意义。

　　四、LncRNA-Co7Rik的生物信息学分析

　　通过UCSC基因组浏览工具分析，发现小鼠LncRNA-Co7Rik序列所在染色体区域Chr8qA1.1，全长1202bp(图4)。设计引物实时RCR后进行核酸电泳，进一步测序后发现序列与数据库中一致，表明这段序列是真实存在的。

　　五、体外糖异生信号激活LncRNA-Co7Rik的表达

　　原代分离小鼠肝细胞，待细胞生长良好后给予1mmol/Ldb-cAMP、10μmol/LForskolin、1μmol/L地塞米松和1μmol/L氢化可的松刺激0h、3h、6h、12h、24h，qPCR检测LncRNA-Co7Rik的表达变化(图6)。将刺激0h的表达量标化为1.00，db-cAMP刺激0h、3h、6h、12h、24h后LncRNA-Co7Rik的表达量分别为1.00±0.12、1.61±0.15、1.82±0.28、1.90±0.23、1.22±0.11，其中3h与24h的表达量与0h相比无统计学差异，6h与12h的表达量显著高于0h(P<0.05)；Forskolin刺激后LncRNA-Co7Rik的表达量分别为1.00±1.10、4.19±1.53、7.82±1.21、39.10±2.28、24.21±1.12(均P<0.01)；地塞米松刺激后LncRNA-Co7Rik的表达量分别为1.00±0.11、2.4±0.15、3.37±0.27、1.90±0.09、1.82±0.13(均P<0.05)；氢化可的松刺激后LncRNA-Co7Rik的表达量分别为1.00±0.09、1.82±0.27、2.53±0.32、3.41±0.18、3.22±0.14，其中除3h与对照组相比无统计学差异，余均有统计学差异(P<0.05)。以上结果表明db-cAMP、Forskolin、地塞米松及氢化可的松均能够时间依赖性地激活LncRNA-Co7RikmRNA的表达。

　　核质分离后，qPCR检测LncRNA-Co7Rik在原代肝细胞细胞质和细胞核的表达水平，表达量分别是1.00±0.37和3.52±0.83(P<0.05)，表明LncRNA-Co7Rik在原代肝细胞细胞质和细胞核内均有表达，但在细胞质内表达量相对较低，细胞核中表达量较高。

　　讨论

　　肝脏的糖异生是将非碳水化合物转化为葡萄糖的过程，对维持机体血糖的平衡具有重要的作用。PEPCK及G6Pase是糖异生信号传导通路中的关键酶，当PEPCK及G6Pase基因表达上调时，肝糖异生增加，肝糖输出增多，血糖水平升高[10]。但是，糖异生的过度激活却是糖尿病等代谢性疾病的主要发病机制。因此，寻找有效的降低糖异生的方法能够为控制胰岛素抵抗、肥胖、2型糖尿病等代谢综合征提供新的思路。

　　六、LncRNA-Co7Rik在肝细胞内的亚定位

　　LncRNA是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200nt的非编码RNA分子，在组织发育、细胞分化、神经代谢性疾病、肿瘤等过程中发挥着重要的作用[11,12]。目前有关LncRNA与肝脏糖、脂代谢的研究报道尚不多。Ruan等[13]发现LncLGR主要存在于肝脏中，由饥饿诱导产生，通过抑制葡萄糖激酶的活化从而调节肝糖原的存储。我们的研究发现，LncRNA-Co7Rik的表达随饥饿进程显著升高，并在再进食后恢复正常水平，提示LncRNA-Co7Rik能受到生理性糖异生信号的调控。LncRNA-Co7Rik高表达于过度糖异生的高脂饮食诱导肥胖模型，提示LncRNA-Co7Rik对病理性的糖异生具有调控作用。进一步研究发现，LncRNA-Co7Rik是一个肝脏特异性高表达的长链非编码RNA，提示与肝脏的代谢功能密切相关。由此可见，LncRNA-Co7Rik可能参与糖异生过程。

　　肝脏的糖异生是饥饿状态下维持血糖平衡的主要途径。饥饿时，血胰岛素水平降低，胰高血糖素和糖皮质激素水平升高，分别通过激活cAMP反应元件结合蛋白(CREB)和糖皮质激素受体(GR)而促进糖异生的作用[14,15,16,17]。为探究LncRNA-Co7Rik是否受生糖信号的调控，我们使用db-cAMP、Forskolin、地塞米松和氢化可的松刺激原代肝细胞，结果表明db-cAMP、Forskolin、地塞米松及氢化可的松均能够时间依赖性的激活LncRNA-Co7RikmRNA的表达。

　　LncRNA的作用机制多种多样，根据其作用方式大致分为3类：(1)通过影响染色质调节基因表达；(2)通过介导转录过程中相关蛋白的功能来改变基因表达水平；(3)在转录后水平调节mRNA和microRNA水平[18,19]。因此，寻找LncRNA的作用机制是揭示其功能的关键。通过亚细胞定位发现LncRNA-Co7Rik主要分布于细胞核中，提示其可能在细胞核中通过调节基因转录发挥作用。

　　综上所述，LncRNA-Co7Rik是一个受生糖信号调控的肝脏特异性长链非编码RNA，并可能参与糖异生生理、病理过程。在后续的实验中我们将重点研究LncRNA-Co7Rik在肝脏糖异生中的作用机制，期望为以后有效治疗过度糖异生导致的代谢性疾病提供新的思路。