LAMA2基因突变致先天性肌营养不良周围神经损害研究

 

对象和方法

 

一、对象

 

对北京大学第一医院儿科2002年至2015年诊治的LAMA2基因相关肌营养不良患儿的周围神经电生理检查进行回顾性分析。纳入标准：(1)对临床拟诊病例行LAMA2基因检测确诊为LAMA2基因相关肌营养不良；和(或)(2)对临床拟诊病例行肌活检组织免疫组织化学染色提示merosin染色阴性；(3)进行神经电生理检查，包括肌电图和神经传导速度检查。排除标准：明确为其他疾病、未行神经电生理检查、失访者。共纳入17例患儿，经所有患儿家长签署知情同意书，并通过北京大学第一医院伦理委员会审查(2015[916])。

 

二、方法

 

1．实验室检查：

 

(1)肌肉活检：患儿行开放式肌肉活检术，肌肉活检组织在异戊烷预冷后在液氮中冰冻固定，冰冻切片，片厚8μm，常规进行组织学和酶组织化学染色，并行免疫组织化学染色，选用merosin抗体(美国Chemicon公司)，抗α－抗肌萎缩相关糖蛋白(α－DG)糖链抗体ⅡH6(美国UpstateBiotech公司)和抗dystrophin抗体(英国Novocastra公司)，采用PV－9000即用型二步法检测试剂盒行免疫组织化学染色。(2)神经活检：患儿于神经内科进行腓肠神经活检，4%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片后进行苏木精－伊红和快蓝髓鞘染色。(3)基因检测：采用Sanger测序或采用靶向捕获二代测序法行LAMA2基因全部外显子测序检测微小突变。对上述方法未发现或仅发现一个致病突变者，采用多重连接依赖的探针扩增技术(MLPA)检测LAMA2基因是否存在拷贝数变异。并对其父母进行进一步验证。靶向基因捕获二代测序委托北京康旭医学检验所有限公司完成。

 

2．电生理检测方法及结果判定：

 

使用Dantec公司Keypoint型肌电图仪检查。检测时室温21～25℃，皮肤温度30℃以上。对肱二头肌、股四头肌、胫前肌3块肌肉行同芯圆针电极肌电图检查，对每块肌肉观察静息电位，轻度肌收缩电位(motorunitpotential，MUP)的时限。在运动神经传导速度(motornerveconductionvelocity，MNCV)检测时，检测了正中神经、尺神经、胫神经、腓总神经；在感觉神经传导速度(sensorynerveconductionvelocity，SNCV)检测时，均采用顺向检测法，检测了正中神经、尺神经、腓肠神经。肌电图正常值参照国内汤氏值、神经传导正常值[5，6]及本室正常值，所测值减慢、延长或降低超过正常值下限2s为异常[7]。

 

三、统计学分析

 

采用SPSS14.0软件进行数据统计分析，对于符合正态分布的计量资料用&plusmn;s表示，不符合正态分布者，用中位数(全距)描述。计数资料用例数(%)描述。对所检测运动神经的传导速度减慢程度与病程进行Pearson相关分析，检验水准α取0.05，采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

 

结果

 

一、临床资料

 

17例患儿中男13例、女4例，行肌电图及神经传导速度测定时年龄1月龄～6岁，其中1～3月龄者3例，4～6月龄者5例，7～12月龄者1例，1～3岁者6例，4～6岁者2例。17例患儿表型均为MDC1A型，均为生后数月内起病，运动发育落后，肌张力低，肌力2～4级，关节挛缩，腱反射减弱或消失，病理征阴性。17例患儿均无感觉障碍、肌束颤动等周围神经病变症状和体征。其中8例行肌活检病理检查，均提示肌营养不良样病理改变，均行merosin染色者，结果为阴性。例12同时进行了腓肠神经活检，提示髓鞘性周围神经病理改变。17例患儿均进行了LAMA2基因检测，除例3外，16例患儿均在基因水平确诊为LAMA2基因相关肌营养不良。但例3的临床及头颅影像学表现，肌酸激酶升高，以及肌肉活检组织merosin染色阴性，支持LAMA2基因相关肌营养不良诊断[8]，故17例患儿均诊断为LAMA2基因突变致先天性肌营养不良，具体见表1。

 

表1

 

17例LAMA2基因相关肌营养不良患儿临床资料与神经传导速度

 

二、电生理检查

 

17例患儿分别进行了1～3块肌肉检查，均出现MUP时限缩短，时限缩短20%～61%，伴或不伴自发电位，支持肌源性损害。其中合并神经传导速度减慢10例，神经传导速度较正常平均值减慢17%～47%。所检神经95根，其中运动神经63根、感觉神经32根。传导速度减慢神经26根(27%)，其中23根为MNCV减慢，仅3根为SNCV减慢。传导速度减慢17%～19%的有2根，占2%；传导速度减慢20%～29%的有15根，占16%；传导速度减慢30%～39%的有7根，占7%。传导速度减慢40%～49%的有1根，占1%。具体数值见表1。4～6岁年龄组神经传导速度减慢程度最为严重。传导速度减慢同时伴有混合肌肉动作电位(compoundmuscleactionpotential，CMAP)波幅降低的有8例，共16根运动神经，降低程度为59%～89%，SNAP波幅均正常。MNCV与正常值的差值和病程均成负相关(正中神经、尺神经、胫神经、腓总神经：r＝－0.737、－0.771、－0.540、－0.682，P均<0.05)，即随着病程的延长，各神经的运动传导速度减慢程度加重。进一步将运动传导速度减慢值与病程建立了一元线性回归模型(表2)，可以根据病程预测患儿的周围神经传导速度。

 

表2

 

神经传导速度与正常值的差值与病程的回归分析

 

讨论

 

LAMA2基因相关肌营养不良是一种常染色体隐性遗传病，由LAMA2基因突变所致。根据临床表型分为MDC1A和LGMD。MDC1A起病早、症状重，多于新生儿期或婴儿早期即出现严重的肌力、肌张力低下，吮吸无力，漏斗胸，近端和远端肌肉均受累，以近端肌力低下为著，早期即可出现关节挛缩。肌力在数年内保持稳定，大部分MDC1A患儿发育里程碑落后，2～3岁时会独坐，不足10%的患儿能独走。呼吸肌受累使部分患儿需要机械辅助通气，大部分患儿死于反复肺部感染。患儿生后早期肌酶可呈显著升高，随着年龄的增长肌酶逐渐下降。所有患儿头颅磁共振成像均可见脑白质信号异常[9]，约10%的患儿可伴智力发育落后、癫痫[10]。MDC1A型在先天性肌营养不良中约占40%，欧美国家较多见[11]。LGMD在儿童期或以后起病，临床症状相对较轻[12]。

 

LAMA2基因定位于6q22－23，包括65个外显子，截止到2016年3月22日在人类基因组突变数据库(HGMD)共报道LAMA2基因致病突变217种，无热点突变[4]。LAMA2基因编码层黏连蛋白α2链，又称merosin蛋白，与层黏连蛋白β1链及γ1链一起共同构成异源三聚体蛋白层黏连蛋白－211。merosin是一种重要的细胞外基质蛋白，存在于横纹肌的基底膜，同时也表达于雪旺细胞[13]、脑血管(以形成血脑屏障)以及胶质界膜。该蛋白的缺陷可造成横纹肌细胞骨架与细胞外基质的连接破坏，导致肌纤维变性、坏死。此外，merosin蛋白缺陷也会影响雪旺细胞的迁移和神经突生长，还会导致周围神经朗飞结处的钠通道蛋白不能正常聚集，从而影响了神经传导速度[14]。而周围神经损害的机制并没有完全阐明，国内外对该病周围神经病变的研究也仅为个例报道，对运动神经及感觉神经受累性质及程度研究较少。

 

本组研究的17例确诊的LAMA2基因相关肌营养不良患儿均为MDC1A型，神经电生理检测时发现，在针极肌电图时测量MUP时限缩短20%～61%，伴或不伴纤颤电位及正锐波，符合肌营养不良的肌肉受损肌电图表现，且均未见宽时限的MUP，可除外因肌肉严重萎缩，而继发的神经源性损害。在测量神经传导速度时，有10例出现神经传导速度减慢。所检95根神经中有23根存在MNCV减慢，同时有16根运动神经的CMAP波幅有不同程度的、均匀一致的降低，但是MUP时限均缩短，故考虑由局部肌肉萎缩引起；仅发现3根SNCV减慢，SNAP波幅未见降低，由此提示MDC1A存在周围神经病变，运动、感觉神经均可累及[15]，病变仅累及髓鞘，而未发现明显轴索损害的表现。

 

其中例12在23月龄时行电生理检查，分别对左右胫神经、腓总神经等4条神经的运动传导速度进行检测，发现其中3条传导速度分别下降24%、25%、25%，CMAP波幅分别下降84%、89%、86%，未见有传导阻滞情况，MUP为短时限、低波幅，提示肌源性损害合并周围神经髓鞘病变，有可能为脱髓鞘或髓鞘形成障碍。该患儿左胫神经传导速度为正常低限，但是其CMAP波幅下降94%。该患儿2岁时同时行左腓肠肌及左腓肠神经活检，肌肉病理改变提示骨骼肌呈终末期病理改变。周围神经的主要病理改变是可见部分薄髓鞘的有髓神经纤维，符合髓鞘性周围神经病的病理改变特点，无洋葱球形成，未见轴索病变。其CMAP波幅明显降低考虑与肌肉严重萎缩相关。由此提示LAMA2基因相关肌营养不良患儿周围神经髓鞘病变不是节段性脱髓鞘病变，而是均匀一致的髓鞘形成障碍改变[16]。肌电图可见周围神经传导速度的减慢，但未见有传导阻滞、波形离散的情况，与组织病理检查一致，均提示该患儿存在周围神经髓鞘形成障碍病变。因腓肠神经为感觉神经，提示感觉神经亦受累。病理检查进一步支持merosin缺乏导致的周围神经病变主要累及周围神经的髓鞘，运动、感觉神经均受累，以运动神经受累为主，以髓鞘形成障碍改变为主，而无轴索病变。

 

本组患儿行电生理检查时年龄0～6岁，从神经传导速度在不同年龄组的下降程度看出，神经传导速度减慢超过30%集中在1～3岁和4～6岁年龄段，尤其以4～6岁组明显。相关分析结果表明，正中神经、尺神经、胫神经、腓总神经的MVCV与正常值的差值和病程存在显著负相关，即MDC1A患者的周围神经传导速度减慢随年龄增长而加重[15]。本组由于只有3根感觉神经检测到SNCV减慢，故未进行分析。

 

研究发现，多数MDC1A患儿在2岁以后血清肌酸激酶迅速下降，到6岁以后可降至正常水平，在2岁时，很多患儿肌活检病理改变即呈终末期病变，课题组另一项针对不同先天性肌营养不良亚型骨骼肌磁共振改变的研究发现MDC1A患儿在不同年龄(1～5岁)其肌肉磁共振具有完全相同受累模式及程度，表现为弥漫性轻中度脂肪化，但是肌萎缩明显[17]。从肌活检组织病理检查也提示肌肉病变很早期即进入终末期，不再进展，提示在肌肉病变不进展的时候，周围神经病变仍在继续加重，这有可能进一步加重肌无力以及并发的脊柱关节畸形。相关结论还需要积累更多病例以及延长随访时间进一步证实。

 

通过对17例LAMA2基因相关先天性肌营养不良患儿的临床、神经电生理及病理分析，可见该病不仅存在肌营养不良的原发性肌肉病变的临床表现，还可以出现周围神经病变，表现为神经传导速度减慢，此改变并不是由于肌肉萎缩后所继发的神经源性损害，而是均匀一致的髓鞘形成障碍，尤其是MDC1A型会有更明显的临床表现和神经传导速度减慢。研究表明，MDC1A患儿的髓鞘形成障碍性感觉运动周围神经病变在幼儿期以后才可检测到，而且随着病程年龄的增长而进展，但是通常程度较轻，多无临床症状。而肌电图的肌源性损害可早在婴儿期即可发现。相关初步结论还有待于积累更多病例，并进行长期、动态的临床、神经电生理以及神经肌肉病理研究进一步完善。本研究为了解此种罕见病的发病机制提供依据，并为今后的治疗和干预选择提供了线索。