探讨呼吸道合胞病毒(RSV)毛细支气管炎患儿的临床特征和病毒的分子生物学特征。
方法
系统性回顾性研究,收集2006年7月至2016年6月首都
儿科研究所毛细支气管炎患儿的鼻
咽部分泌物标本(NPA)进行多种呼吸道病毒抗原检测;RSV阳性标本实时PCR法区分亚型;扩增RSVG蛋白全基因确定基因型别;改良Tal评分法评价疾病严重程度。采用t检验、Mann-WhitneyU检验及χ2检验。
结果
2296例分泌物标本中,961例(41.9%)为RSV阳性,其中719例(74.8%)为RSVA亚型,236例(24.6%)为B亚型;10年间亚型转换模式为A-A-B-B-A-A-B-AB-A-AB,且在A亚型流行季发病例数较多。RSVG蛋白全基因序列分析结果提示6种A亚型基因型(NA1、NA2、NA3、NA4、GA5、ON1)和5种B亚型基因型(BA3、BA7、BA9、BA10、CB1)在北京地区被检出,A亚型中以NA1基因型(55.9%)和ON1基因型(39.1%)为主导基因型,2014年以前以NA1为主(50.0%~100%),之后以ON1为主(68.0%~90.9%);B亚型以BA9(90.6%)为绝对优势基因型。对比NA1感染与ON1感染患儿,NA1感染者中位住院时间8d、ON1患儿中位住院时间6d(U=1.035,P=0.005),且其中重度者(中度:41.0%,重度:10.0%)比ON1患儿(中度:22.9%,重度:4.3%)多(U=9.785,P=0.008);而ON1患儿出现发热症状的比例(38.6%)较NA1感染者(15.0%)高(χ2=11.064,P=0.001),其低月龄者(0~3月龄)所占比例(54.3%)高于NA1感染者(33.0%)(χ2=77.408,P<0.001)。
结论
北京地区毛细支气管炎患儿中RSVA、B亚型轮换或共同主导不同的流行季,多个基因型共同存在,基因型别与疾病的临床特征和严重程度存在一定相关性。
毛细支气管炎是一种婴幼儿较常见的下呼吸道感染,主要症状是喘息和肺部哮鸣音。其主要病原为病毒,以呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus,RSV)感染最常见,占50%~80%[1]。
RSV属副黏液病毒科肺炎病毒属,分为A、B两个抗原亚型。两个亚型之间变异最大的蛋白是G蛋白,在两个亚型内的变异高达20%[1,2,3]。G蛋白胞外区包含黏蛋白样高可变区HVR1和HVR2,通过对HVR2的核苷酸序列分析,可以将A、B亚型分为多个基因型。RSV基因变异速度快,新基因型频繁出现。2012年初加拿大研究者报道了A亚型的新基因型ON1后[4],该基因型在许多国家相继检出,已逐渐取代了此前的A亚型主导基因型NA1。BA基因型自发现以来一直是主导的B亚型基因型,大部分地区以BA9分支最为流行[5,6,7,8]。RSV存在毒株特异性,其型别的不同,可能会影响RSV疾病的严重程度、暴发流行、发病机制等方面[9]。
本研究对毛细支气管炎患儿的鼻咽分泌物标本(nasopharyngealaspirates,NPA)进行RSV检测,并对部分RSV阳性标本进行序列分析,与患儿临床资料进行比较。
对象和方法
一、样本收集和处理
本研究为大样本的系统回顾性研究。收集2006年7月至2016年6月至首都儿科研究所附属儿童医院就诊,临床诊断为毛细支气管炎的患儿NPA标本2296例,其中门诊患儿标本363例、住院患儿标本1933例。每份标本加入2mlHank′s液吹打混匀,3000r/min(离心半径14cm)离心10min,上清液部分用于病毒核酸提取,剩余-20℃保存;沉淀(主要为脱落的呼吸道上皮细胞)应用D3UltraDFARespiratoryVirusScreen&IDKit试剂盒(DiagnosticHybrids,美国)采用直接免疫荧光法(directimmunofluorescenceassay,DFA)进行7种常见呼吸道病毒抗原的快速检测,包括RSV、腺病毒(ADV)、
流感病毒A(FLUA)、流感病毒B(FLUB)、副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(PIVⅠ、Ⅱ、Ⅲ),按照试剂盒说明进行操作,同时应用荧光素(FITC)标记的偏肺病毒(HMPV)单克隆抗体(DiagnosticHybrids,美国)采用DFA法对HMPV进行检测。
本研究经首都儿科研究所伦理委员会批准(批准文号:SHERLLM2015012)。
二、病毒核酸提取及反转录反应
标本上清液150μl,TRIzol法(Invitrogen,美国)进行RNA提取。以提取的RNA为模板,随机引物(Invitrogen,美国)和反转录酶(M-MLV,Invitrogen,美国)合成cDNA,-20℃备用。
三、RSVA、B亚型的区分及ON1基因型的确定
通过实时PCR区分RSVA、B亚型,所用的探针引物参考本实验室先期的研究工作[10]。反应条件:50℃2min;95℃10min;95℃15s,60℃1min,45个循环。通过循环阈值(cyclethreshold,Ct)的大小判断实验结果(Ct值≤40为阳性,Ct值>40为阴性)。
对RSVA亚型阳性标本cDNA采用引物S5405和A5534进行PCR[11],确定是否属于ON1基因型。反应条件:94℃5min;94℃30s,49℃30s,72℃30s,40个循环;72℃7min;4℃保存。
引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成,序列信息见表1。
四、RSVG蛋白全基因扩增、序列测定及分析
对RSV阳性的毛细支气管炎住院患儿标本进行基因序列分析,确定RSV基因型别。采用本实验室设计的引物S4298[5]和F164[3]进行PCR反应,扩增A、B两个亚型的G蛋白基因全长。反应条件:94℃5min;94℃30s,49℃30s,72℃2min,45个循环;72℃7min;4℃保存。对于PCR产物较弱或无产物的标本,继续用二次引物S4373、F5763进行巢式PCR,反应条件:94℃5min;94℃30s,42℃30s,72℃2min,40个循环;72℃7min;4℃保存。扩增产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行序列测定。
测序结果通过NCBIBLAST明确是否为RSVG蛋白基因序列;应用ChromasLite2.22软件确定测序结果色谱图正确;序列拼接编辑所用软件为DNAStar的Seqman。运用MEGA6.0软件将所获得序列与GenBank中已确定基因型的参考株的G蛋白基因序列进行同源性比较,确定RSV基因型别。
五、临床资料收集
对RSV基因型别确定的毛细支气管炎住院患儿进行病例检索,收集临床资料,包括年龄、性别、临床表现、治疗、转归、实验室检查等,比较不同亚型及不同基因型毛细支气管炎患儿的临床特征。疾病严重程度用改良的Tal评分法评价(表2)[12,13],主要以各年龄组病例中均有明确记录的呼吸频率、哮鸣音、血氧饱和度(SpO2)及三凹征为指征,于住院当天采集信息。按评分进行病情严重程度分组:轻(0~4分)、中(5~8分)、重(9~12分)。
六、统计学方法
采用SPSS20.0统计软件,连续变量以&plu
smn;s或M(范围)或中位数表示,采用t检验或Mann-WhitneyU检验;分类变量以例(%)表示,采用χ2检验;P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、儿童中毛细支气管炎的流行病学及病原学特征
共收集毛细支气管炎患儿标本2296例,占送检儿童呼吸道疾病标本的3.51%(2296/65361)。各年度不同月份毛细支气管炎的标本收集情况见图1,每年的11月起该类标本量逐渐升高,高峰在12月至次年2月,至次年3—4月降低至较低水平,因此将每年的11月至次年的4月定义为毛细支气管炎流行季。在2006—2007、2007—2008两个流行季,毛细支气管炎患儿标本均占儿童呼吸道疾病标本的10%以上,之后呈现下降趋势。
图12006-2016年不同月份毛细支气管炎标本收集情况
2296例的毛细支气管炎患儿中男1818例(79.2%),女475例(20.7%);1933例(84.2%)为住院患儿,其余为门诊患儿;门诊患儿中3例性别信息缺失,3例年龄信息缺失。对2293例年龄信息完整的患儿进行分析,毛细支气管炎患儿平均年龄为(5.7±3.7)月龄,其中6月龄以内65.8%。
呼吸道病毒抗原检测RSV阳性者961例(41.9%);PIV阳性者142例(6.2%),包括PIVⅠ4例,PIVⅡ3例,PIVⅢ135例;FLU阳性者21例(0.9%),包括FLUA17例,FLUB4例;ADV阳性者19例(0.8%);HMPV阳性者10例(0.4%);另有合并阳性者8例,包括RSV合并PIVⅢ1例,RSV合并PIVⅠ3例,RSV合并ADV1例,RSV合并FLUA1例,ADV合并FLUA1例,ADV合并PIVⅢ1例。
二、毛细支气管炎患儿中的RSV亚型分布情况
对仅RSV抗原检测阳性的标本961例,经实时PCR方法确定A亚型719例(74.8%),B亚型236例(24.6%),A、B亚型混合6例(0.6%)。10个流行季的RSV亚型分布情况见图2。A、B两个亚型在每个流行季均可被检出,但检出阳性率差异很大,A亚型为主的有5个流行季:2006—2007、2007—2008、2010—2011、2011—2012、2014—2015年;B亚型为主的有3个流行季:2008—2009、2009—2010、2012—2013年;A、B两个亚型阳性检出率无明显差别的有两个流行季2013—2014、2015—2016年。在A亚型为主的流行季中送检的毛细支气管炎患儿标本相对较多。
图2儿童毛细支气管炎中呼吸道合胞病毒亚型分布
三、RSV阳性毛细支气管炎患儿中的RSV基因型分布
自2012—2013年流行季开始检出A亚型ON1基因型。比较ON1与非ON1基因型的分布(图3),第一例ON1基因型检出于2013年1月,该流行季以B亚型为主导;在2013—2014年A亚型为主导的流行季ON1开始成为主导基因型;至2015年3月后非ON1基因型已鲜有检出,以2015—2016年流行季为例,仅检出1例。
图3呼吸道合胞病毒阳性毛细支气管炎患儿中的呼吸道合胞病毒基因型分布
对RSV阳性毛细支气管炎住院患儿标本(673例)进行G蛋白全基因扩增及序列测定,成功获得232例G蛋白全基因序列(A亚型179例、B亚型53例),序列分析结果表明有6种A亚型基因型(NA1、NA2、NA3、NA4、GA5、ON1)、5种B亚型基因型(BA3、BA7、BA9、BA10、CB1)被检出。10个流行季各亚型的基因型分布情况见表3。A亚型中以NA1基因型(55.9%)和ON1基因型(39.1%)为主导基因型,其中2014年以前以NA1检出为主(50.0%~100%),之后以ON1为主(68.0%~90.9%);B亚型以BA9(90.6%)为绝对优势基因型。
四、RSV亚型间以及基因型间的临床特征和病情严重程度比较
对RSV亚型及基因型别确定的232例RSV毛细支气管炎住院患儿进行亚型间及基因型间的临床特征比较,结果见表4。A、B亚型间临床特征无明显差异,但NA1阳性患儿与ON1阳性患儿进行临床特征比较:NA1感染者住院时间(中位数8d)比ON1患儿(中位数6d)长(U=1.035,P=0.005);而ON1患儿出现发热症状的比例(38.6%)较NA1感染者(15.0%)高(χ2=11.064,P=0.001),其低月龄者(0~3月龄)所占比例(54.3%)也比NA1(33.0%)更高(χ2=77.408,P<0.001);另外虽然两者白细胞计数的差异有统计学意义(t=-4.033,P=0.031),但均在正常范围内。
用改良的Tal评分评价RSVA、B亚型和NA1、ON1基因型所致疾病严重程度(表4),结果表明A、B亚型间差异无统计学意义,但NA1患儿中重度者比例(中度:41.0%,重度:10.0%)高于ON1患儿(中度:22.9%,重度:4.3%)(U=9.785,P=0.008)。
讨论
毛细支气管炎是儿科最常见的急性下呼吸道感染性疾病之一,好发于冬春季,RSV是其最常见的病原。本研究毛细支气管炎患儿标本量从每年的11月起逐渐升高,发病高峰在12月—次年2月,至次年3—4月降至较低水平,与RSV流行季节一致[8];41.9%的毛细支气管炎为RSV感染所致。国内报道的毛细支气管炎患儿中RSV检出率(30%~50%)[14,15]比国外略低(50%~80%)[1],可能与地域差异和检测方法相关。本研究显示PIV尤其是PIVⅢ亦是重要病原,且各毛细支气管炎流行季PIVⅢ阳性检出例数稳定。鼻病毒(HRV)是毛细支气管炎的第二位病因[1],但由于DFA方法的局限,本研究中的病原学检测项目中未能涵盖HRV。
RSVA、B亚型轮换或共同主导不同的流行季。其交替流行模式在不同的国家和地区不同,南非2006—2008年度以A亚型为优势亚型,2009—2012年度转为BABA交替流行的模式[6];比利时1996—2005年度的研究显示其亚型流行模式由AAB循环模式转变为AB交替循环[16];重庆地区2009—2013年度亚型转换模式为BAAB[17],本研究RSV毛细支气管炎患儿以RSVA亚型为主(74.8%),2006—2016年10年间的亚型转换模式为A-A-B-B-A-A-B-AB-A-AB,大部分流行季以一个亚型为主,但有两个流行季为A、B亚型共同主导,这种共同主导现象本实验室在2005—2006流行季度也曾监测到[18]。成人与儿童中的RSV亚型转换模式相似[5,19],提示主导亚型的转换反映了本地群体免疫的特点。说明全球通用的RSV
疫苗困难较大,应根据地区特点选择疫苗株。
本研究中A亚型流行季RSV所致毛细支气管炎发病例数较多,本实验室报道过在A亚型主导流行季呼吸道感染患者出现高峰[18],推测可能是因为RSVA亚型更易引起大范围的流行。
国内外研究均报道多种RSV基因型可以在同一地区共流行。南非一项对RSV15个年度的监测检出了16个基因型,A、B亚型各占8种[6];Liu等[20]报道上海2009—2012年度共检出10个基因型,仅2009—2010年度就检出7种,并确定与RSV的暴发流行相关。近年来,多数报道中A、B亚型的主导基因型分别为NA1和BA,但不同地区BA基因型的流行分支会有所不同,大部分报道以BA9为主[5,6,7,8],而一项南非开普敦地区的研究只检出了BA4一种基因型[21],发现在柬埔寨地区以BA7和BA10流行[22]。本研究显示毛细支气管炎患儿中检出了6种A亚型基因型(NA1、NA2、NA3、NA4、GA5、ON1)和5种B亚型基因型(BA3、BA7、BA9、BA10、CB1);部分基因型仅在特定时间的少数标本中检测到,而A、B亚型的主导基因型分别是NA1和BA9,直至ON1基因型出现并逐渐取代NA1的主导地位。ON1基因型首先于2010年在加拿大安大略省检出,该基因型的特点是HVR2区存在72核苷酸重复片段的插入,类似于BA基因型大片段插入的特征[23],随后ON1基因型在世界各地均有报道[6,7,8]。ON1基因型本课题组于2012年2月检出,本研究于2013年1月检出。推测这种大片段插入可能有利于病毒逃逸宿主的免疫压力,使ON1成为新的主导基因型。
本研究仅成功获得232例G蛋白全基因序列,由于G蛋白全基因扩增产物量低,未能测到序列;或未能得到G蛋白全基因扩增产物,比较后发现近期标本的G蛋白扩增和测序成功率高于远期的标本,推测可能是由于部分标本冻存时间较久。
RSV亚型与疾病严重程度尚无定论,多数研究认为A亚型较B亚型感染病情重[24,25],有研究认为亚型和疾病严重程度并无相关性[26]。本研究对比A、B亚型感染患儿临床特征和临床评分并无显著差异。基因型-表型间的关系研究受到越来越多的关注,RSVA2株(GA1)和临床分离株BT2a(GA5)感染WD-PBECs的体外模型[27],发现BT2a株引起的细胞病变比A2株更严重,且其感染时存在更多的与黏液分泌相关的杯状细胞;Martinello等[26]研究发现GA3基因型感染后病情较GA2、GA4严重;意大利研究表明NA1基因型相较ON1基因型更易引起下呼吸道感染(P<0.0001),并且住院比例更高(P=0.007)[7],而越南学者则认为ON1基因型感染后病情比NA1更重,引起喘息和呼吸窘迫的可能更高,导致更严重的下呼吸道感染[28]。本研究对NA1感染患儿与ON1感染患儿进行比较,发现ON1患儿更易伴随发热症状,且3月龄以下者比例更高,ON1感染的低龄化曾有报道[28,29];而NA1患儿住院时间更长(U=1.035,P=0.005),且中重度者比例高于ON1患儿(U=9.785,P=0.008)。