2010年1月至2014年12月上海儿童医学中心PICU婴儿脓毒症病例130例，根据脓毒症诊断标准分为脓毒症组(51例)和严重脓毒症组(79例)，同期健康
体检儿童作为对照组(108例)。根据28d病死率将严重脓毒症组分为生存组(45例)和死亡组(34例)两个亚组。测定各组血清组蛋白浓度，并分析其与疾病严重程度及预后的相关性。培养人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)，用小牛胸腺组蛋白(calfthymushistone，CTH)以不同浓度(0、50、100、200及300μg/ml)及不同时间(200μg/mlCHT处理0、5、15、30、45、60min)处理后，用流式细胞仪检测细胞存活率，以电镜观察细胞的形态学变化，以Westernblot检测核因子(nuclearfactor，NF)-κB及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信号通路中NF-κB抑制因子IκB以及磷酸化p38/p38表达，以ELISA检测肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6表达水平。
结果
严重脓毒症组患儿血清组蛋白水平(19.17&plu
smn;10.20)显著高于脓毒症组(2.29±1.00)及对照组(0.23±0.26)(P<0.001)，并且在严重脓毒症患儿中，死亡患儿血清组蛋白水平显著高于存活者(29.47±5.99vs.10.94±2.68，P<0.001)。体外实验发现，随CTH处理时间或者剂量增加，HUVEC的生存率逐步下降。扫描电镜和透射电镜观察CTH处理后HUVEC发现细胞膜破坏现象。组蛋白可以激活NF-κB及MAPK通路，并释放肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6等炎性因子。
结论
在脓毒症患者中胞外组蛋白浓度与疾病严重程度相关。CTH可以呈剂量依赖性及时间依赖性诱导HUVEC死亡。胞外组蛋白在脓毒症中通过对
血管内皮细胞的毒性作用，介导疾病进程，而这一毒性作用与破坏内皮细胞细胞膜及激活NF-κB及MAPK信号通路有关。
脓毒症(sepsis)是当前重症监护病房所面临的棘手难题，病死率高达18%～29%[1]。脓毒症病理过程复杂，涉及大量细胞因子、炎性介质与凝血系统的激活，其中血管内皮细胞损伤导致的功能改变在其发病过程中起着重要作用[2]。脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克、多脏器功能不全综合征(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)的发生是一个动态过程，有效地遏制脓毒症的发展进程，对降低脓毒性休克及MODS的发生率和病死率十分重要。
到目前为止，尚没有一项可单独用于脓毒症患者疾病进展和预后的评估指标。2009年，Xu等[3]首次报道细胞外组蛋白在脓毒症小鼠血清中的含量显著高于正常小鼠，利用抗体中和组蛋白可以明显抑制脓毒症小鼠的死亡，说明细胞外组蛋白是脓毒症的主要致死性因素。目前仍少有研究关注脓毒症患者疾病严重程度和胞外组蛋白浓度之间的关系。因此，本研究将探讨脓毒症患儿胞外组蛋白水平与脓毒症严重程度之间的关系，并探究组蛋白对内皮细胞毒性损伤的作用机制。
1对象与方法
1.1研究对象及分组
2010年1月至2014年12月收集上海儿童医学中心PICU婴儿脓毒症病例130例，其中男72例(55.4%)，女58例(44.6%)。发病年龄为1～12个月，平均年龄4.4个月。根据脓毒症诊断标准分为脓毒症组(51例)和严重脓毒症组(79例)，同期儿保科健康体检婴儿作为对照组(108例)，其中男64例，女44例，年龄1～12个月，平均年龄6.3个月。根据28d病死率将严重脓毒症组分为生存组(45例)和死亡组(34例)两个亚组。脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克、MODS的诊断参照2005年美国胸科医师学会/危重病医学会发布的拟订标准[4，5]；排除标准：(1)基础疾病预后恶劣，并可能成为患者死亡的主要原因；(2)
恶性肿瘤终末期；(3)自身免疫性疾病。该临床研究通过上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心的伦理批准并签署了知情同意书。
1.2主要试剂与细胞
人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)购于美国ATCC公司；组蛋白检测CellDeathDetectionKit购于美国Roche公司；FITC-抗AnnexinV/PI购于美国BD公司；核因子(nuclearfactor，NF)-κBP65、NF-κBP50、NF-κB抑制因子(IκB)Ba抗体购于CST公司；肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)-α，白细胞介素(interleukin，IL)-6试剂盒购于美国Bio-Rad公司。
1.3方法
1.3.1临床样本采集及血清组蛋白检测
患儿入院或被诊断为脓毒症后即刻采集外周血1ml，以1500转/min转速分离8min后吸取上清，保存于－80℃，用于ELISA检测前置于室温解冻。胞外组蛋白的检测按ELISA检测试剂盒方法[6]，在包备有抗DNA抗体的96孔板加入20μl患儿血浆，在室温下孵育2h，再加入生物素标记的抗组蛋白抗体，在室温下孵育20min，再利用分光光度计检测405nm和490nm的吸光度值。
1.3.2细胞培养处理及流式细胞仪检测
取对数生长期HUVEC，按5×105个细胞接种到6孔板，第2天经不同浓度和不同处理时间的小牛胸腺组蛋白(calfthymushistone，CTH)处理后收集细胞，离心，经过处理及AnnexinV/PI染色后，流式细胞仪检测细胞存活率，AnnexinV/PI双染色阴性细胞为存活细胞。不同浓度的CTH：0、50、100、200及300μg/ml，在37℃，5%CO2环境下孵育1h；不同处理时间的CTH：200μg/ml处理0、5、15、30、45、60min。
1.3.3电镜标本制备
经50或200μg/mlCTH孵育HUVEC1h后，用体积分数为4%的戊二醛固定，再经脱水、包埋、切片、醋酸铀-硝酸铅双重染色制成超薄切片，在电镜下观察组蛋白对血管内皮细胞的损伤。
1.3.4Westernblot检测NF-κB及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信号通路中NF-κB抑制因子IκB以及磷酸化p38/p38表达
组蛋白孵育HUVEC后，裂解细胞，经Westernblot检测IκB的蛋白水平以及P38蛋白的磷酸化水平。选取不同孵育浓度(0、50、100及200μg/ml)和200μg/ml下不同处理时间(0、15、30、45、60min)以检测IκB的蛋白水平以及P38蛋白的磷酸化水平是否与组蛋白的处理时间和剂量相关。
1.3.5TNF-α和IL-6的检测
按ELISA检测试剂盒方法，除空白孔外，加入标本或不同浓度标准品各100μl至相应孔中，37℃孵育60min；洗板后依次加入生物素抗体、酶结合物100μl/孔，37℃各孵育60min、30min；加显色剂，避光孵育10～25min；终止液终止，即刻测量OD450值，并根据标准曲线查出其浓度。
1.4统计学方法
所有数据均应用SPSS19.0统计分析软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示，各指标变化的组间比较采用独立样本t检验或方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1胞外组蛋白水平与脓毒症的严重程度相关
严重脓毒症组患儿血清组蛋白水平(19.17±10.20)显著高于脓毒症组(2.29±1.00)及对照组(0.23±0.26)(P<0.001)，见图1。在严重脓毒症患儿中，死亡患儿血清组蛋白水平显著高于存活患儿(29.47±5.99vs.10.94±2.68，P<0.001)，见图2。
2.2CTH可直接引起血管内皮细胞死亡，并呈现剂量依赖性和时间依赖性
CTH与内皮细胞共同孵育，用50μg/ml的CTH处理1h就可以使HUVEC的存活率明显下降，随着CTH浓度增加，可导致内皮细胞死亡增加，且呈剂量依赖性(图3)。200μg/mlCTH处理HUVEC15min就可以使HUVEC的存活率明显下降，随着共同孵育时间增加，可导致内皮细胞死亡增加，呈时间依赖性(图4)。
2.3CTH对血管内皮细胞损伤电镜观察结果
扫描电镜和透射电镜都可以观察到，50μg/ml的CTH即可轻微损伤细胞膜，200μg/mlCTH孵育HUVEC后，其细胞膜严重破损(图5A3中的黑洞，图5B3中放大的细胞膜部分)；细胞核中的染色质出现凝集(图5B3)。
2.4CTH激活NF-κB和MAPK信号通路
如图6、图7所示，CTH处理会导致IκB蛋白的降解以及p38磷酸化水平的增加，NF-κB和MAPK通路被激活。并且，IκB蛋白的降解以及p38磷酸化水平的增加呈现CTH处理时间和剂量的依赖性。随着CTH孵育浓度的增加或处理时间的延长，IκB的蛋白水平逐渐降低，p38磷酸化水平逐渐升高，提示NF-κB和MAPK通路的激活程度增加。但当CTH浓度为50μg/ml时，IκB的蛋白水平并未受到影响，提示此浓度还不足以激活NF-κB信号通路。
2.5CTH促进HUVEC释放TNF-α和IL-6
经不同浓度的CTH孵育HUVEC后，通过ELISA检测细胞上清中的TNF-α和IL-6水平，结果显示CTH可促进TNF-α和IL-6的释放(图8、图9)。并且，TNF-α和IL-6的释放呈现剂量依赖性。在50μg/mlCTH处理时，TNF-α的浓度为(137.15±28.16)pg/ml，IL-6为(3.89±0.87)pg/ml；而200μg/mlCTH处理时，TNF-α的浓度为(312.36±32.57)pg/ml，IL-6为(5.81±0.76)pg/ml。
3讨论
组蛋白是一种带有强正电荷的核蛋白，正常的生理功能是在核内与DNA相结合形成核小体，并发挥调控基因表达的作用。但是当组蛋白被主动或被动地释放到细胞外空间后可以在多个系统或器官中发挥促炎作用和直接的毒性作用[7，8，9，10]。尽管Xu等[3]的研究表明，胞外组蛋白在脓毒症小鼠中是致死的关键因素，但是目前尚没有相关的临床研究证明胞外组蛋白与脓毒症疾病严重程度及预后的关系。在本研究中，我们发现脓毒症患儿的胞外组蛋白较健康儿童有明显增高，而且其水平与疾病严重程度相关。因此，升高的胞外组蛋白水平有可能被用作一种提示脓毒症疾病进展程度和疾病预后的临床生物指标。脓毒症的病理生理过程相当复杂，涉及多种细胞的激活、炎症因子的释放和凝血系统的启动。脓毒症疾病进展的一个重要受累组织是血管内皮。血管内皮的完整对于维持血流动力学正常，防止凝血途径异常激活和适度的免疫反应有着重要作用，而以上三项正是脓毒症发展的重要条件[11]，而内皮细胞的活化和功能障碍是脓毒症发展恶化的中心环节[12，13]。中性粒细胞激活后形成的胞外诱捕网(neutrophilextracellulartraps)和组蛋白已经在体外实验中多次被证实对上皮细胞和内皮细胞有毒性作用[3，14，15]，但其相关机制尚不明。本研究的结果显示，组蛋白可以破坏内皮细胞细胞膜，导致或部分导致细胞死亡，造成内皮细胞功能障碍。而全身内皮细胞活化可以导致微血管病变，微血管通透性增高，白细胞黏附和迁移，活性氧家族的活化，血管扩张和细胞因子的产生致使组织乏氧，最终导致器官功能障碍甚至死亡[16]。
此外，本研究显示组蛋白可以激活HUVEC中的NF-κB及MAPK信号通路，而NF-κB作为参与基因表达和调控的一种重要的诱导性核转录因子，其激活可导致TNF-α、IL-6等炎症介质的大量表达和释放，这些炎症介质的表达和释放又会进一步加强炎症信号通路的激活，促使正反馈环的形成，最终导致过度炎症反应。而组蛋白损伤内皮细胞后，又进一步促使其释放组蛋白，从而再促进中性粒细胞释放胞外诱捕网和加重内皮细胞的损伤，引起“细胞因子瀑布”，进一步加重脓毒症的快速进展，并引发多脏器的损伤。
本研究统计显示婴儿脓毒症或严重脓毒症患者，往往起病急，进展快，多在收入PICU48h内给予积极抢救治疗后仍无好转死亡。此类患儿如何早期识别和干预，对改善预后至关重要。我们在体外研究中发现，组蛋白对内皮细胞毒性作用与剂量及作用时间有关；同时在临床研究中发现，组蛋白水平与脓毒症患者的疾病严重程度和预后相关。因此血清组蛋白在一定程度上可以表明疾病的严重程度，早期和连续检测可以判别治疗的效果。这种变化在生存组与死亡组中的差异亦非常显著。胞外组蛋白在严重脓毒症早期即有明显升高，故可作为严重脓毒症的早期识别指标。
组蛋白作为一种损伤相关的模式分子可以用于提示组织和脏器的损伤[17]，组蛋白通过破坏内皮细胞细胞膜和激活NF-κB及MAPK通路放大其组织损伤的程度，这也是组蛋白可能成为治疗和控制炎症反应的治疗靶点的理论依据。脓毒症患儿胞外组蛋白绝对水平与其病死率相关。因此，危重症患者合并脓毒症时检测血清组蛋白有助于早期诊断、监测病情发展及判断预后。及时筛选出重症患儿，进行干预，阻断其引发的瀑布效应，阻止脓毒症的进程，降低病死率。
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