检测分析肠道病毒7
1型(EV71)感染手足口病患儿外周血CD8+T细胞数量变化与患儿年龄以及病情严重程度之间的关系,进而分析探讨CD8+T细胞在EV71感染
神经系统并发症发生中的潜在作用。
方法
收集2014年3月至9月昆明市儿童医院感染科确诊的手足口病患儿138例,其中普通型33例,重型45例,危重型60例。患儿年龄9个月~5岁。采用流式细胞术对外周血中CD8+T细胞亚群进行检测。
结果
与各年龄段健康儿童CD8+T细胞参考值相比,除~2岁年龄段普通型手足口病患儿CD8+T细胞百分比增高明显,~5岁年龄段危重型手足口病患儿CD8+T细胞减低外,其他各年龄段各病情患儿中CD8+T细胞均增高或略高。其中,9~15个月普通型、重型患儿外周血CD8+T细胞百分比增高均较明显,而危重型患儿略增高;~2岁患儿随病情加重CD8+T细胞增高幅度逐渐减低;~5岁年龄段患儿,普通型增高不明显,重型略高,危重型减低。~2岁年龄段普通型与重型、危重型手足口病患儿CD8+T细胞百分比均存在显著差异(P均<0.05);而其他年龄段手足口病患儿,不同病情严重程度者CD8+T细胞的表达无显著差异(P均>0.05)。
结论
CD8+T细胞的表达变化与患儿年龄及病情严重程度间存在一定的关系;尤其是~2岁年龄段手足口病患儿体内CD8+T细胞的表达减低与患儿病情发展至重症相关,推测CD8+T细胞在~2岁年龄段手足口病患儿很可能发挥重要的
抗病毒免疫反应。
肠道病毒71型(EV71)是引发儿童手足口病的主要致病病原体之一[1,2,3],具有嗜神经毒性,但具体致病机制还不清楚[4,5,6];对于其感染后机体内部清除病毒的免疫防御机制也尚无定论[7,8]。一些对
流感病毒以及登革热病毒的研究发现,CD8+T细胞在中枢神经系统中具有持续稳定的清除病毒的能力[9,10,11]。而对于EV71感染后,CD8+T细胞的表达变化在手足口病患者体内是否具有一定的作用,目前国内外研究还尚无定论。基于健康儿童的淋巴细胞表达与其年龄大小具有很大的相关性[12],本研究主要针对EV71感染后不同年龄、不同病情手足口病患儿外周血淋巴细胞亚群中CD8+T细胞的表达情况,判断分析CD8+T细胞的表达变化与EV71感染手足口病患儿病情的严重程度及患儿年龄间存在的关系,进而推测年龄相关的CD8+T细胞介导的细胞毒性T细胞反应(CTL)在EV71致重症手足口病中可能发挥的潜在作用。
1对象与方法
1.1病例标本采集
按照卫生部《手足口病诊疗指南》(2010年版)中的病例纳入标准以及《肠道病毒71型(EV71)感染重症病例临床救治专家共识》(2011年版)的诊断标准,对2014年3至7月间在昆明市儿童医院感染科确诊的普通型、重型以及危重型手足口病病例进行空腹静脉血采集。基于本研究主要研究的是淋巴细胞,而在儿童成长过程中其体内淋巴细胞亚群变化与年龄密切相关,本研究主要根据目前国际上儿童淋巴细胞亚群分类标准[12],收集年龄分别处于9~15个月、~2岁、~5岁年龄段的不同病情患儿的血标本,共收集138例,包括普通型33例(9~15个月、~2岁、~5岁患儿各11例);重型45例(9~15个月、~2岁、~5岁患儿各15例);危重型60例(9~15个月、~2岁、~5岁患儿各20例)。上述病例采集均具有患儿家属知情同意书,且通过了昆明医科大学医学伦理委员会批准。
1.2试剂及主要仪器
试剂:采用BD公司生产的检测淋巴细胞亚群的试剂盒BDMultitest6-colorTBNKReagent。该试剂盒中包括识别富集不同淋巴细胞亚群(T细胞、B细胞以及NK细胞)的抗体,其中包括识别NK细胞的抗体(CD16和CD56PE)、识别T细胞的抗体(CD3FITC)、CD45PerCP-Cy?5.5、检测CD4+T细胞的CD4PE-Cy?7、识别B细胞的CD19APC以及识别CD8+T细胞的CD8APC-Cy7。主要检测仪器:BDFACSCanto?,使用BDFACSCanto?软件进行参数设置、质控监测以及数据分析。
1.3流式细胞仪检测
采集静脉血2~3ml,注于EDTA-Na抗凝管中。按照操作说明书,分别向已编好号的试管中加入20μl六色单克隆抗体和同型对照;分别向试管中加入混匀的100μl抗凝血;混匀,避光,室温孵育15~20min;加入已稀释好的溶血素600μl混匀避光室温溶血8~10min;上机检测。
1.4统计学分析
所有数据均采用SPSS17.0软件进行统计学分析。CD8+T细胞的表达以中位数(M)和95%CI表示,采用单因素方差分析及方差分析中的SNK法进行组间分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1CD8+T细胞在9~15个月年龄段手足口病患儿外周血中的表达情况
与健康儿童CD8+T细胞参考值(18%)相比,9~15个月年龄段普通型、重型手足口病患儿外周血中CD8+T细胞相对百分比增高均较明显,而危重型患儿略微增高;该年龄段各病情患儿间CD8+T细胞表达差异均无统计学意义(P均>0.05)(表1)。
2.2CD8+T细胞在~2岁年龄段手足口病患儿外周血中的表达情况
与健康儿童CD8+T细胞参考值(20%)相比,~2岁年龄段普通型、重型及危重型手足口病患儿外周血中CD8+T细胞百分比从明显增高逐渐减低;该年龄段普通型与重型及危重型手足口病患儿间CD8+T细胞表达差异均有统计学意义(P均<0.05),而重型与危重型手足口病患儿间CD8+T细胞表达差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。
2.3CD8+T细胞在~5岁年龄段手足口病患儿外周血中的表达情况
与健康儿童CD8+T细胞参考值(24%)相比,~5岁年龄段普通型手足口病患儿外周血中CD8+T细胞百分比基本无变化,重型患儿略微增高,危重型患儿减低;该年龄段各病情患儿间CD8+T细胞表达差异均无统计学意义(P均>0.05)(表1)。
3讨论
本研究通过对不同病情、不同年龄段手足口病患儿外周血中CD8+T细胞的表达变化分析,发现~2岁年龄段手足口病患儿的CD8+T细胞表达减低与患儿病情发展具有相关性,而其他年龄段手足口病患儿CD8+T细胞的表达变化与患儿病情发展的严重程度关系不大。一方面说明,CD8+T细胞的表达变化在一定的年龄范围内(~2岁)与手足口病患儿病情的严重程度具有相关性;另一方面推测在其他年龄段与患儿病情发展严重程度有关的免疫因素很可能与其他免疫细胞有关,如CD4+T细胞、NK细胞、B细胞等,这很可能与年龄相关的淋巴细胞亚群分布不同有关,即在病毒感染后,不同年龄段患儿体内发挥抗病毒免疫作用的淋巴细胞可能不同。
本研究中,~2岁年龄段患儿病情发展至重症时,其体内CD8+T细胞数量减低,推测该年龄段重症手足口病患儿体内CD8+T细胞诱导的细胞毒性T细胞杀伤效应很可能较弱,该杀伤效应很可能受到EV71病毒复制的干扰或抑制。基于本结果推测,当手足口病患儿处于~2岁年龄段时,临床上判断患儿病情发展时可重点关注患儿外周血中CD8+T细胞的表达变化,如果患儿CD8+T细胞表达出现减低,可能是病情恶性发展的风险因素。另外,本研究中~5岁危重型患儿CD8+T细胞减低,而与普通型及重型组间无显著差异的原因,后期需增加样本量进一步证实。
对于重症手足口病患儿中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)并发症发生的原因,很可能与病毒感染后CNS中CD8+T细胞免疫反应低下有关。病毒感染CNS后,一般会引发慢性炎症或者死亡。在CNS中,一般存在的都是晚期分化的细胞,其能够忍受病毒的持续存在。虽然存在免疫反应,但是宿主更偏向于避免因免疫反应引发的免疫病理损伤而快速下调CNS的免疫效应[13,14]。其原因可能与MHC分子的上调表达、专职抗原呈递细胞减少、有效淋巴细胞产生减少以及血脑屏障对淋巴细胞进入的限制等有关[15,16]。有研究发现,出生小鼠CNS感染病毒时,CD8+T细胞往往会被招募进入CNS中进行较弱的免疫清除病毒效应。但当该小鼠再次被该病毒感染后,对特定抗原有记忆的CD8+T细胞会被快速招募并进入CNS杀伤病毒感染细胞,进而对CNS产生保护作用。这样的CNS保护机制在嗜神经元的流感病毒、登革热病毒以及
轮状病毒的研究中都被证实是存在的;这些研究认为CD8+T细胞在CNS中具有持续稳定的清除病毒的能力[9,10,11]。那么,对于外源性的嗜神经病毒EV71感染手足口病患儿CNS中CD8+T细胞的作用如何,目前还无结论。根据本研究结果,我们推测EV71入侵CNS后,最初受到CNS中CD8+T细胞的清除,但由于CNS对于免疫反应的过度控制,导致CNS中免疫反应较弱,病毒无法被全部清除出去,当病毒持续感染时,病毒很可能利用宿主体内的某些机制不断完成子代病毒颗粒的复制,同时逃避免疫系统的监视或者干扰、抑制体内免疫细胞的扩增和活化效应,进而导致机体免疫功能低下或免疫细胞产生耐受。当外周CD8+T细胞扩增不明显或明显减低时,患儿CNS中感染EV71的细胞也逐渐增多,此时,CNS能够招募的外周CD8+T细胞数量有限,进而因CNS中较弱的CTL反应而无法完全清除CNS中的所有病毒,最终导致患儿重症病情的发生。对于这一推测的证明,后续研究将对感染EV71的小鼠在初次感染EV71以及持续感染阶段,其脑组织中CD8+T细胞表达分化以及活化分子效应进行深入研究。CD8+T细胞作为与CNS免疫反应密切相关的免疫细胞,其免疫效应的高低将直接决定患儿神经系统并发症发生的严重程度[17]。因此,对于其相应的免疫信号活化途径与病毒之间的相互作用[18]也值得重点关注,并进一步深入探讨。