儿童呼吸道病原的获取与解读

　　呼吸道感染是儿童常见的疾病，引起呼吸道感染的病原十分复杂，包括病毒、细菌、肺炎支原体、真菌等。呼吸道病原学的分析研究对儿童呼吸道感染的临床诊断及治疗具有重要意义。本文就儿童呼吸道病原体的获取和解读做一简单的介绍。

 

　　呼吸道感染是儿科常见的疾病，由于儿童免疫功能未发育健全，故病情往往较成人更为严重，尤其下呼吸道感染是PICU中最常见的死亡原因之一。引起呼吸道感染的病原十分复杂，包括病毒、细菌、非典型菌、真菌等，且新的病原不断被发现，如冠状病毒、偏肺病毒、博卡病毒等，常给疾病的诊断和治疗带来一定的困难。在临床诊疗过程中，普遍的经验性抗生素治疗不仅造成了医疗费用的增高与抗生素相关的附加损害增多，也增加了细菌的耐药机率。因此，了解和掌握儿童呼吸道病原体的特点，对诊断、治疗和预防呼吸道感染均非常重要。本文就儿童呼吸道病原体的获取和解读做一简单介绍。

 

　　临床上常通过咽拭子、痰液和胸水或血液等标本的检查来获取呼吸道病原，但传统的咽拭子或痰培养对下呼吸道感染病原菌的诊断有时并不准确。纤维支气管镜下气管内导管吸引或毛刷可取得较好的下呼吸道标本，防污染毛刷，尤其是双腔管保护性标本刷的应用使污染率明显下降。采用顶端带气囊的防污染导管进行支气管肺泡灌洗，既可获得大量灌洗液标本，又可使污染率下降，更能正确反映呼吸道病原学[1]，被认为是目前呼吸道病原获取和诊断较为敏感和可靠的方法。

 

　　1.1采集及保存呼吸道标本的注意点

 

　　标本正确的采集、运送及保存是确保检验结果准确的前提，因此在这些过程中应注意[2]：(1)标本尽可能在病程早期或急性期采集，并从呼吸道(咽部、鼻咽部或支气管等处)采样；(2)严格的无菌操作，避免污染；(3)采集合格的痰液标本对细菌的诊断尤为重要，要求合格的痰标本应符合鳞状细胞低于10个/低倍视野，白细胞大于5个/低倍视野，并且呼吸道分泌物(痰、支气管肺泡灌洗液等)的量应在0.5ml以上，若少于0.5ml，应加入2ml转运液送检；(4)双份血清抗体检测，应在恢复期(约2周)再次采血；(5)采集后应尽快送检，一般要求2h内送到实验室。若需保存，应4℃保存，时间不超过24h。

 

　　1.2实验室诊断方法及检测结果的意义

 

　　实验室检查对感染性疾病的早期诊断非常重要，病原体的直接检出和分离培养成功可以直接明确诊断；用免疫学方法检测病原体的特殊抗原/抗体，也可为临床提供重要的依据。病原的主要检测方法有以下几种：(1)细菌形态学检查是细菌检验中非常重要的检测手段，分为不染色和染色两种方法。临床上常用的染色方法有革兰染色、抗酸染色和荧光染色。不染色直接镜检反映的是细菌在正常状态的运动状态，而染色标本反映的是细菌的形态、大小及排列方式。(2)病原体分离：可证实被检标本中具有复制能力和传染性的病原体，因此临床意义大，被认为是诊断感染性疾病的“金标准”。对于分离的结果应结合患者临床资料、标本种类及采样时机等综合分析，直接从病变部位分离到的可信度高，而从粪便或尿中分离到时应谨慎考虑。这种情况下应联合抗体检测方法对诊断更有帮助。病毒分离技术特异性强，但检测耗时较长，很多情况下只能做回顾性诊断；而细菌的分离技术不能完全取代细菌培养，后者更为准确可靠。(3)特异性抗原的检测：应用免疫学方法检测病原的特异性抗原常常用于早期诊断，常用的方法有免疫对流电(counterimmunoelectrophoresis，CIE)、协同凝集试验(coagglutinationtest，COA)、乳胶凝集试验(latexagglutinationtest，LA)、免疫荧光(immunofluorescence，IF)、酶联免疫吸附(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)、放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)等技术。抗原检测相对简便，可做到快速、早期诊断。一般来讲，检测到某种病原就可诊断为该病原感染，但结果为阴性时，不能轻易排除，需综合考虑并联合其他检验手段来诊断。这里重点提到的是聚合酶链反应技术(polymerasechainreaction，PCR)，该技术敏感性极高，能检出极其微量的病毒核酸，但PCR结果阳性，并不一定说明存在该病毒的感染。G试验和GM试验是检验真菌特异性抗原的重要检验方法。G试验检测的是真菌细胞壁的成分(1，3)-β-D-葡聚糖，该检查的关键点在于标准化的操作及临界值的确定，存在假阳性可能。GM试验主要用于侵袭性曲霉菌感染的诊断，是检测曲霉释放的半乳甘露聚糖，特异性较高。值得注意的是，GM试验连续两次结果阳性比单次的结果阳性具有更大的临床意义，连续两次结果阳性作为诊断标准能提供更好的准确度。为了提高诊断结果的可靠性，可以对曲霉菌感染的高危患者进行连续监测[3]。(4)特异性抗体的检测：病原体急性感染后，早期机体产生IgM类抗体，持续时间较短，约为2～3个月，是病原诊断的可靠依据。在感染后期或恢复期，机体产生IgG类抗体，持续时间较长，往往在数月以上，甚至终生存在。用于特异性抗体的检测方法很多，有IF、ELISA、RIA等方法。如果恢复期抗体滴度达到急性期滴度的4倍或以上，可诊断为急性感染，特异性也很强，但双份血清抗体检测的最大缺点是不能作早期诊断。值得一提的是，6个月内的患儿抗体产生能力较差，需联合其他检测方法来明确诊断。

 

 

　　2.1病毒

 

　　病毒是在活细胞中生长、复制的最小微生物，是引起急性呼吸道感染常见的病原，不同病毒的易感人群也有所不同，感染季节以冬、春季为主。随着近年来分子生物学、免疫学、病毒学等学科的快速发展，国内病毒引起下呼吸道感染的病例数逐渐增多。国内大量研究表明，不同下呼吸道感染疾病的病毒阳性率从30.1%到63.6%，部分报道不同病毒的混合感染率可达70%[4，5]。引起呼吸道感染常见的病毒有呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)、流感病毒(influenzavirus，IFV)、副流感病毒(parainfluenzavirus，PIV)、腺病毒(adenovirus，ADV)等。

 

　　2.1.1RSV

 

　　RSV是引起儿童呼吸道感染最常见的病原之一，多见于婴幼儿，潜伏期为2～8d，在急性下呼吸道感染中阳性率可达50%以上[6]。研究表明，RSV感染患儿后，呼吸道黏膜被大量炎性细胞浸润，出现水肿，且分泌物增多，从而引起呼吸道阻塞，易导致喘息[7]。目前对RSV关注越来越多的是基因型，迄今为止已发现14种A亚型基因型：Gal-GA7、SAA1、NAl-NA4、CB-A、ON1和25种B亚型基因型：Ba1-Bal1、URU1-URU2、GB1-GB5、SAB1-SAB4、THB、BA-C和CB1[8，9，10，11，12]。RSV感染流行病学的特点为不同流行年度A、B亚型共循环，每年一般以一个优势亚型为主，并且疾病严重程度还可能与基因型有关[13]。

 

　　2.1.2IVF和PIV

 

　　IFV是儿童呼吸道病毒感染中最主要病原之一，分为A、B和C(IFA、IFB、IFC)3型，根据其包膜上的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)可分为许多亚型，2009年流感暴发的亚型就是IFA中的H1N1。人感染后多表现为呼吸道症状，偶尔也会出现胃肠道症状，合并细菌感染后能导致较高的病死率[14，15]，而小于5岁的儿童感染IFV后并发重症疾病风险较高[16]。研究表明，IFV感染每年可导致10%～15%的儿童就诊或住院，其中住院的急性下呼吸道感染儿童中IFV检测阳性率为1.4%～35.4%[17，18，19]。PIV流行也较为广泛，以PIV3多见，但相对毒力较弱，引起喘息的机率较RSV低[20]。

 

　　2.1.3ADV

 

　　ADV流行一年四季均可发生，以夏季及冬春季多见。有研究报道，北京地区ADV的感染率为1.69%，主要引起5岁以下儿童的急性呼吸道感染，以3、7型为主[21]。该病毒可在人体的扁桃体、淋巴结和肠道组织中长期潜伏存在，可引起不同的临床疾患，往往能造成多脏器损伤，可引起急性发热性呼吸道感染、咽结膜热、肺炎、流行性角结膜炎和胃肠炎等疾病。

 

　　2.1.4偏肺病毒(humanmetapneumovirus，HMPV)

 

　　HMPV是2001年发现的，为单分子负链RNA目，副黏病毒科，发病呈全球流行。我国不同地区发病率不同，5%～30%[22]。儿童感染HMPV与感染RSV引起的呼吸道疾病在临床特征上无大差别[23]，除肺炎、气管炎外，还可引起鼻炎、咽炎、中耳炎、口腔炎、结膜炎等疾病，其中中耳炎最常见。实时RT-PCR技术是目前检测HMPV感染的最敏感、最有效的方法。

 

　　2.1.5其他病毒

 

　　EB病毒是一种嗜人类淋巴细胞的疱疹病毒，约90%以上的成人EB病毒抗体阳性[24]。除原发感染所致的传染性单核细胞增生症外，在儿童时期还可出现两种较为严重的疾病，即慢性活动性EB病毒感染和EB病毒相关噬血淋巴组织细胞增生症。该病毒与结膜炎、腮腺炎、心肌炎、间质性肺炎、胰腺炎等疾病相关。

 

　　巨细胞病毒属疱疹病毒科，基因为双股线性DNA，其感染在全球范围内占40%～100%，新生儿先天性感染发生率为1%～5%，引起肝炎较多，肺炎较少见[25]。巨细胞病毒肺炎表现为间质性肺炎，临床缺乏特异性表现，体征不明显，严重者预后不良。

 

　　2.2细菌

 

　　对于儿科各专业来说，细菌感染广泛存在。呼吸道病原菌的分布特点仍以革兰阴性菌为主，但儿童患者中阳性菌的比率高于成人[26]。近年来，随着广谱抗生素不合理应用及细菌基因突变等原因，越来越多的细菌出现了耐药。目前，耐万古霉素的金黄色葡糖球菌，耐碳青霉烯的大肠杆菌，泛耐药的鲍曼不动杆菌等细菌都是临床医生碰到的棘手问题。引起呼吸道感染常见的细菌有肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae，SP)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus，SA)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)、肺炎克雷白菌(klebsiellapneumoniae)、大肠埃希菌(escherichiacoli)等。

 

　　2.2.1SP

 

　　SP是临床常见的主要病原菌之一，可以引起肺炎、中耳炎、鼻窦炎、脑膜炎和脓毒症等疾病。据WHO估计，每年大约有160万人死于SP感染，其中5岁以下儿童占43.8%～62.5%，且大多数分布在发展中国家，SP性疾病已成为5岁以下儿童死亡的首位致死因素[27]。目前，SP对β内酰胺类的耐药问题已演变成全球性的问题。欧洲国家青霉素不敏感SP(penicillin-nonsusceptibleStreptococcuspneumoniae，PNSSP)的检出率，据EARSS报道，德国、法国、英国和西班牙2008年分别为5%、30%、5%和23%，2010年分别为4%、28%、3%和30%[28]。中国CHINET细菌耐药性监测网报道，我国大陆地区2014年儿童PNSSP的检出率为20.2%[29]。SP对大环内酯类抗生素的耐药形势也不容乐观，红霉素不敏感SP的检出率持续处于高位。随着PNSSP和红霉素不敏感SP的出现，SP的抗菌治疗变得更加严峻。

 

　　2.2.2SA

 

　　SA是引起医院感染的主要致病菌，可寄居于人的鼻前庭、会阴、皮肤，可引起感染而导致多种疾病，如脓毒症、导管源性感染、肺炎、伤口感染、全身性感染、毒素休克综合征、烫伤样皮肤综合征及心内膜炎等，日益引起人们的重视[30]。近年来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistantstaphylococcusaureus，MRSA)的检出率逐年增高，据报道北京儿童医院的MRSA检出率由2003年的3.1%上升到2012年的20.1%[31]。虽然儿科MRSA的检出率比成人低，但此增加趋势却不容忽视。因此，监测SA的分布及耐药情况、合理应用抗菌药物至关重要。

 

　　2.2.3肺炎克雷白菌

 

　　肺炎克雷白菌是一种重要的社区以及院内感染病原菌，其所致感染占所有院内感染10%左右[32]。据2011年CHINET数据，ICU住院患儿检出率为14.4%，略高于成人[26]。近年来，随着碳青霉烯类药物的广泛使用，耐碳青霉烯类肺炎克雷白菌株显著增加，给临床治疗带来巨大困难与挑战。肺炎克雷白菌中检测到的碳青霉烯酶基因种类繁多，每个地区流行的耐药株也各有特点。因此，在正确认识耐碳青霉烯类抗生素的菌株，规范使用碳青霉烯类抗生素的前提下，建立全方位的感染控制干预机制，开展一系列的感染控制措施非常必要。

 

　　2.2.4流感嗜血杆菌

 

　　流感嗜血杆菌是社区获得性呼吸道感染的主要病原菌。根据2011年CHINET数据，流感嗜血杆菌成人分离株和儿童分离株中，β内酰胺酶检出率分别为16.8%和34.8%，对氨苄西林耐药率分别为22.5%和35.9%，对氨苄西林-舒巴坦、头孢菌素类敏感率均大于80%[26]。因此，大多数抗菌药物(特别是酶抑制剂复方制剂)对流感嗜血杆菌仍然保持较好的抗菌活性。

 

　　2.2.5鲍曼不动杆菌

 

　　鲍曼不动杆菌是引起医院内(特别是ICU)患者获得性肺炎的主要条件致病菌。根据2011年CHINET数据，在PICU中，该菌的分离率为25.7%，仅对米诺环素、头孢哌酮-舒巴坦耐药率稍低，分别为23.2%、43.6%，对其余抗菌药物包括亚胺培南、美罗培南耐药率均>60%[26]，因此引起了临床医师的高度重视。资料显示替加环素是米诺环素的衍生物，体外药敏结果显示对鲍曼不动杆菌也具有较好的抗菌活性[33]。

 

　　2.2.6大肠埃希菌

 

　　大肠埃希菌是人体正常菌群，也是呼吸道感染的常见菌。大肠埃希菌ESBLs的检出率逐年增高，2011年CHINET数据为80.1%，较作者所在单位高；耐碳青霉烯的大肠埃希菌检出率为2.8%～3.3%，泛耐药的为1%[26]。虽然在大多数情况下，针对该菌的抗生素选择较多，但碳青霉烯类耐药或泛耐药的大肠埃希菌的出现对临床抗感染构成了严重的威胁。

 

　　2.3非典型菌

 

　　2.3.1肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae，MP)

 

　　MP感染可累及各年龄组儿童的组织器官，以下呼吸道感染最常见。其感染可持续散发或不定期流行，每3～7年发生一次流行高峰，10%～40%会进展为肺炎，但也有20%是无症状的[34]。目前，MP耐药率逐年上升，中国部分地区达到100%，日本其次，最高达70%，而欧美地区远低于亚洲地区[35]。对于重症或耐药的MP感染，除大环内酯类还可选用多西环素、米诺环素、左氧氟沙星等药物[36]，但使用前必须评估风险并取得家长同意。

 

　　2.3.2肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae，CP)

 

　　CP是严格细胞内寄生的人类病原体，目前仅发现一种血清型。约10%的社区获得性肺炎是由CP感染所致，年龄越小感染率越低，青壮年既往感染率可达50%，老年达75%[37]。研究发现自身免疫病患者，尤其是类风湿关节炎和系统性红斑狼疮患者，肺炎衣原体IgM抗体阳性率显著高于对照组，提示CP感染与自身免疫病发病有关[38]。

 

　　2.3.3军团菌

 

　　军团菌是广泛存在于天然淡水环境和人工水系中的机会致病菌，常见的有嗜肺军团菌、麦氏军团菌、长滩军团菌等，其中嗜肺军团菌是引起社区获得性肺炎和医院内获得性肺炎的重要病原菌。我国以散发病例为主，大环内酯类药物治疗有效，但应加强中央空调及水环境的消毒管理，减少军团菌感染风险。

 

　　2.4真菌

 

　　念珠菌和曲霉菌是儿童侵袭性真菌病(invasivefungaldisease，IFD)最主要的致病菌，念珠菌最常见，尤其是在新生儿，其中白假丝酵母菌和近平滑假丝酵母菌IFD约占1/2～2/3[39]。研究显示，黏膜损害、各种置管、抗生素应用、多部位念珠菌定植是侵袭性念珠菌病的危险因素，血液病及恶性肿瘤及其治疗、异体干细胞移植、长时间激素应用、粒细胞减少、免疫抑制或免疫缺陷、实体器官移植、ICU住院是侵袭性曲霉菌病的危险因素，而急性髓细胞性白血病儿童和急性淋巴细胞白血病复发的儿童是侵袭性曲霉菌病的高危人群[40]。据统计，血液病及恶性肿瘤儿童IFD中，曲霉菌感染占36%～44%，在肺移植儿童中占57.14%[40]。肺部曲霉菌感染，空洞和新月征多见于年长儿童和成人，小儿的病灶更多为支气管肺炎的影像学改变，而GM实验有助于诊断。

 

　　呼吸道病原学的分析研究对儿童呼吸道感染的临床诊断及治疗具有重要意义。临床医生在诊疗过程中，可以根据当地及本科室的病原学流行特点，合理选择抗病毒和抗菌药物，避免抗生素的滥用，从而提高治愈率，并减少医疗资源浪费及耐药菌菌株的出现。