目的
探讨肾上腺素对内毒素(lipopolysaccharide,LPS)所致大鼠肺损伤的保护作用及其作用机制。
方法
30只SD大鼠随机分为3组(每组10只):正常对照组大鼠静脉输注生理盐水2.4ml/(kg·h);LPS组大鼠静脉注射LPS6mg/kg后,静脉输注生理盐水2.4ml/(kg·h);肾上腺素组大鼠静脉注射LPS6mg/kg后,静脉输注肾上腺素0.6μg/(kg·min)。在LPS注射后2h和6h通过心导管抽血,ELISA法检测血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-10水平,并在6h处死大鼠取肺脏组织,分别予肺组织含水量检测,HE染色观察肺组织病理学变化,以及ELISA法检测肺泡灌洗液(BALF)内TNF-α、IL-6和IL-10水平。
结果
(1)与正常对照组肺含水量(70.19%&plu
smn;5.87%)相比,LPS组肺含水量(85.24%±5.87%)明显升高(P<0.05),与LPS组相比,肾上腺素组肺含水量(78.00%±6.41%)明显降低(P<0.05)。(2)病理观察结果显示,LPS组大鼠肺泡隔内毛细血管充血、水肿及炎症细胞浸润,少部分肺组织可见肺不张及肺泡内水肿、出血。肾上腺素组大鼠肺病理损伤较LPS组明显减轻。(3)与LPS组相比,肾上腺素组各时点血清TNF-α及IL-6水平明显降低(P<0.05),IL-10水平明显升高(P<0.05)。(4)与LPS组相比,肾上腺素组大鼠BALF中TNF-α水平降低[(78±9)ng/Lvs.(102±16)ng/L],IL-6水平降低[(268±42)ng/Lvs.(347±50)ng/L],IL-10水平升高[(210±23)ng/Lvs.(146±34)ng/L](P<0.05)。
结论
肾上腺素可减轻LPS诱导的急性肺损伤,其保护作用可能与降低TNF-α、IL-6水平,升高IL-10水平有关。
严重脓毒症及感染性休克是儿科常见危重症,也是多器官功能障碍综合征(multipleorgandysfunctionsyndrome,MODS)的最重要原因[1,2,3]。在MODS启动过程中,肺脏是最早受累及损伤最重的器官,如果在急性肺损伤阶段处理不及时,会继续进展至急性呼吸窘迫综合征乃至多器官功能衰竭甚至危及生命。因此减轻肺损伤对治疗脓毒症具有重要意义。
近年研究发现肾上腺素有抗炎作用。对于肾上腺素在体内能否通过其抗炎作用来减轻脓毒症引起的急性肺损伤,目前还不清楚。故本研究通过观察肾上腺素对内毒素(脂多糖,LPS)致大鼠肺损伤的病理学变化以及血清和肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)中炎症介质水平的影响,探讨肾上腺素能否减轻脓毒症引起的肺损伤及其作用机制,为肾上腺素能否作为抗炎
药物治疗脓毒症及感染性休克提供理论依据[4]。
1材料与方法
1.1实验动物及试剂
无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠30只(由广东省医学实验动物中心提供),体重250~300g。盐酸肾上腺素注射液(广州白云山明兴
制药有限公司);大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-10的酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(奥地利Bender公司);大肠杆菌脂多糖(LPS,Escherichiacoli0111:B4,美国Sigma公司)。
1.2实验动物准备
行大鼠心导管留置术,建立静脉通路:2%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉,无菌条件下分离并暴露右颈外静脉,置入直径约1.0mm的一次性硬脊膜外麻醉导管至右心室,并固定。行心导管留置术后16~20h通过微量推注泵(IVACP3000,Alarismedicalsystems公司)静脉给药。大鼠术后及实验期间自由饮食。
1.3分组及处理
按随机数字表法将30只SD大鼠随机分成3组,每组10只:正常对照组大鼠静脉滴注生理盐水2.4ml/(kg·h);LPS组大鼠10min内缓慢静脉注射LPS6mg/kg后[4,5],静脉滴注生理盐水2.4ml/(kg·h);肾上腺素组大鼠静脉注射LPS6mg/kg后,静脉输注肾上腺素0.6μg/(kg·min)。每100毫升生理盐水中加入1.5mg肾上腺素配成肾上腺素溶液,以保持相同的给药体积,即2.4ml/(kg·h)。各组大鼠持续滴注生理盐水或肾上腺素溶液6h。观察各组大鼠的一般情况。
1.4样本采集
在静脉注射LPS后2h和6h2个时点通过心导管采血1ml,并回输等量生理盐水。血样室温下静置2h,3000r/min离心15min分离血清,-20℃冰箱储存待测。
1.5肺组织处理及观察项目
静脉注射LPS6h后,腹腔注射
氯胺酮麻醉处死各组大鼠,并取肺组织标本。(1)肺组织含水量检测:取左肺下叶组织,剔除支气管,吸干表面水分后称质量,此为湿质量;干燥48h后称质量,此为干质量。依公式计算,肺组织含水量(%)=[(湿质量-干质量)/湿质量]×100%。(2)肺组织病理学观察:均取左肺上叶组织,用10%甲醛固定后,经脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、HE染色、透明处理封片后,光镜下观察肺组织病理学改变。(3)左肺门结扎,每次用2ml生理盐水对右肺进行反复肺泡灌洗3次,回收BALF,将BALF3000r/min离心15min,上清液-20℃保存,留作检测炎症介质水平。
1.6BALF及血清炎症介质测定
采用ELISA法测定BALF及血清TNF-α、IL-6和IL-10浓度,操作按说明书进行。
1.7统计学处理
采用SPSS11.0统计软件处理,计量数据以均数±标准差(±s)表示。多样本间均数的比较采用单因素方差分析,均数间两两比较采用Games-Howell法。两样本均数比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1动物一般情况观察
在注射LPS2h后,LPS组大鼠不同程度地出现了直肠温度升高或降低,心率加快,呼吸急促,且
精神状态差,萎靡,蜷缩成一团,刺激不活动,未见摄食及饮水,达到动物脓毒症的诊断标准。
2.2肺组织含水量的变化
与正常对照组肺含水量(70.19±5.87)%相比,LPS组肺含水量(85.24±5.87)%明显升高(P<0.05)。与LPS组相比,肾上腺素组肺含水量(78.00±6.41)%明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3血清中炎症介质表达
注射LPS后2h,肾上腺素组血清TNF-α浓度显著低于LPS组(P<0.05)。在6h各组大鼠血清中均未能检测出TNF-α。注射LPS后2h和6h,肾上腺素组血清IL-6浓度显著低于LPS组(P<0.05)。注射LPS后2h和6h,肾上腺素组大鼠血清中IL-10水平较LPS组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。
2.4BALF中炎症介质表达
肾上腺素组BALF中TNF-α浓度及IL-6浓度显著低于LPS组(P<0.05),IL-10水平较LPS组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组大鼠BALF中未能检测出TNF-α及IL-10,见表2。
2.5肺组织病理学变化
光镜下,正常对照组大鼠肺组织结构完整,肺泡间隔内无水肿、炎症细胞浸润等炎性改变。LPS组大鼠小支气管内可见少量渗出物,肺小动脉血管周围间质水肿,肺泡隔内可见毛细血管充血、水肿及炎症细胞浸润,部分肺泡内水肿及出血,少部分肺组织出现肺不张致肺泡塌陷融合以及代偿性肺气肿。肾上腺素组与LPS组比较,肺毛细血管充血减轻,肺水肿减轻,炎症细胞浸润减少,未见肺泡内出血,偶见肺不张及代偿性肺气肿,见图1。
3讨论
本研究从炎症反应的角度探讨了肾上腺素能否减轻LPS诱导的大鼠急性肺损伤。本研究结果显示肾上腺素可减轻LPS诱导的肺组织病理学损伤,减少肺水含量,并可降低血清和BALF中TNF-α和IL-6水平,升高血清和BALF中IL-10水平。结果表明在急性肺损伤早期,肾上腺素可减轻LPS引起的大鼠肺病理学损伤,其保护作用可能是通过其抗炎作用实现的。
在本实验中,大鼠静脉注射LPS后,肺组织病理学上表现为肺毛细血管充血、肺水肿及局部肺不张,提示成功建立了急性肺损伤动物模型。在动物急性肺损伤模型中,内毒素型是最常用的模型之一[4]。内毒素是革兰阴性菌胞外膜成分,是脓毒症的主要致病原,内毒素进入体内后可诱导机体出现失控的炎症反应,激活巨噬细胞释放炎症介质,并激活中性粒细胞在肺内扣押产生局部炎症反应而产生肺损伤。急性肺损伤是以肺泡毛细血管膜损伤为基础,渗透性肺水肿和微肺不张为特征的综合征,可发展为急性呼吸窘迫综合征、MODS。各种病因刺激下产生大量的炎症介质,形成炎症反应的“瀑布效应”,促炎/抗炎介质失衡,导致严重脓毒症及MODS,其中急性肺损伤往往是最早出现的。TNF-α是机体受到有害刺激后在单核巨噬细胞中最早分泌的、起关键作用的促炎细胞因子,可诱导其他炎症介质级联释放。IL-6可在TNF-α和IL-1诱导下产生,是使炎症放大的重要因子。过量的炎症介质如TNF-α、IL-6等能促进中性粒细胞的活化、聚集,释放大量弹性蛋白酶及氧自由基,造成肺毛细血管内皮细胞及肺泡上皮细胞损害,肺血管通透性增高,引起肺水肿及肺不张,是导致肺损伤的重要因素。IL-10是由Th2细胞产生的一种重要的抗炎因子,可以抑制促炎因子如TNF-α及IL-12等的产生,降低内毒素血症动物的死亡率[6]。
本实验结果显示肾上腺素可降低血清和BALF中TNF-α和IL-6水平,升高血清和BALF中IL-10水平,而国外文献报道的体外实验及动物实验也有类似的结果。有体外研究显示,肾上腺素可下调内毒素诱导的巨噬细胞TNF-α、IL-1β、活性氧自由基、NO和巨噬细胞炎症蛋白-1α表达,上调IL-10的表达[7,8,9,10]。在vanderPoll等[11]研究中,健康志愿者静脉注射LPS前预先给予肾上腺素持续滴注,可减少TNF-α的生成,促进IL-10的生成。一些研究也显示很多儿茶酚胺类物质都具有抗炎作用,提示这一类药物可能通过共同的途径发挥抗炎作用[12,13,14]。刘伟和刘志[15]研究显示,早期使用去甲肾上腺素可减少脓毒性休克大鼠BALF及血清炎症介质的浓度,减轻大鼠肺损伤程度。在脓毒症早期,促炎介质过量,抗炎介质不足,机体主要表现为促炎反应过度,此时减轻促炎反应,增强抗炎反应,对减轻脓毒症引起的肺损伤具有重要作用。结合本实验和文献研究结果,我们认为肾上腺素可减轻LPS诱导的肺损伤,其保护作用可能是通过降低促炎因子的表达,促进抗炎因子的表达来实现的。
Philippakis等[16]研究显示肾上腺素可减轻LPS诱导的大鼠肺损伤,可减少肺部细胞间黏附因子-1表达,可降低肺部CD4+T细胞数量,减轻LPS诱导的肺部炎症反应。其实验与我们的结果一致,均发现肾上腺素可减轻LPS诱导的大鼠肺损伤,但其发挥保护作用的机制不同,需进一步研究。
综上所述,肾上腺素可减轻LPS诱导的急性肺损伤,其保护作用可能与降低促炎介质TNF-α、IL-6水平,升高抗炎介质IL-10水平有关。