【临床研究与实践】脆性X综合征二例CGG重复序列及甲基化分析！

　　【临床研究与实践】脆性X综合征二例CGG重复序列及甲基化分析！

　　摘要

　　目的

　　比较脆性X综合征男性胎儿不同组织中CGG重复扩增和甲基化情况。

　　方法

　　分别于2013年8月、2012年5月采集1例全突变和1例前突变/全突变嵌合23周终止妊娠男性胎儿的不同组织样本，并提取基因组DNA。联合高GC含量PCR和甲基化敏感Southern印迹技术，测量各组织中CGG重复数、分析甲基化水平，并通过实时PCR和Western印迹分析FMR1表达情况。

　　结果

　　两例胎儿各组织间CGG重复数目一致，但嵌合胎儿各组织中CGG重复甲基化情况不同，1例脑、皮肤、睾丸和肾组织，均有1个约为540个CGG重复的主要全突变条带，完全甲基化。另1例脑区、皮肤、睾丸、肺、胃、肠道、肝、肾、心脏以及外周中血均检测到160、470和1100个CGG重复的3条主要条带。检测出脑组织中前突变比例最低，相应FMPR表达最少。

　　结论

　　明确了CGG重复扩增和甲基化的组织异质性。基于嵌合胎儿母亲为全突变，推测母源全突变CGG重复在三胚层分化前缩减。

　　脆性X综合征(fragileXsyndrome，FXS)是引起遗传性智力低下和孤独症谱系障碍最常见的单基因病[1]，95%以上的FXS患者是由于FMR1基因5’非编码区CGG重复序列扩增导致其蛋白FMRP表达沉默所致。FXS的临床表型与FMRP表达量密切相关，由于部分患者为嵌合体，因为具有非甲基化正常或前突变等位基因能表达部分FMRP，因此FXS患者表型个体差异较大。本研究拟通过比较CGG重复序列在不同组织中的长度和甲基化情况，从而确定全突变CGG数目是否存在组织异质性，明确嵌合体胎儿前突变和全突变的比率在不同组织是否存在差异，为FXS临床诊断提供证据。

　　病例资料

　　经受试对象家属知情同意，中南大学医学遗传学国家重点实验室伦理委员会审查批准(批准文号2013051202)，采集1例全突变和1例前突变/全突变嵌合23周终止妊娠男性胎儿的不同组织样本。提取组织样本基因组DNA，联合高GC含量PCR和甲基化敏感的Southernblot技术，与已知CGG重复数目标准品对照，确定各组织中CGG数目，并分析甲基化情况。

　　例1

　　全突变病例，为23周终止妊娠男性胎儿。其母亲38岁，经我室FXS诊断为CGG重复数为97/25的前突变携带者(premutation，PM)，无明显表型，有FXS家族史，曾生育1例FXS全突变/前突变嵌合男性患儿，2013年8月经产前诊断后终止妊娠1例FXS全突变男性胎儿(例1胎儿)。经检测，例1的脑、皮肤、睾丸和肾组织，均有1个约为540个CGG重复的主要全突变条带，完全甲基化(图1)。

　　例2

　　前突变或全突变嵌合病例，为23周终止妊娠男性胎儿。其母亲25岁，经我室FXS诊断为全突变患者，有FXS家族史。该母亲月经尚规则，无震颤等现象，妊娠期间无放射线、毒物接触史，但计算能力差，未行智力测试，曾于2011年5月终止妊娠1例FXS全突变女性胎儿，2012年5月终止妊娠1例FXS前突变/全突变男性胎儿(例2胎儿)，2013年生育1名CGG重复数目正常男孩。例2胎儿(即2012年5月终止妊娠的男性胎儿)脑区、皮肤、睾丸、肺、胃、肠道、肝、肾、心脏以及外周中血均检测到160、470和1100个CGG重复的3条主要条带，各组织CGG重复数目均相同，但前突变所占比例存在明显的组织差异，与中胚层、内胚层来源组织比较，外胚层来源的脑区前突变条带较弱(图2)。灰度分析表明前突变比例在脑中最低(<3%)，外周血中最高(>15%)，其他组织居中。定量PCR和Westernblot分析显示睾丸及肾中FMR1表达最高，脑组织中表达甚微(图3，4)。

　　讨论

　　CGG重复在人群中具有高度多态性，正常范围为6～54，CGG重复数突变至55～200的个体称为前突变携带者[2]，在世代传递中前突变CGG重复序列极不稳定，CGG数目大于100的女性前突变携带者生育CGG数目超过200的全突变患儿风险达94%～100%[3]。FXS男性患者常表现出中度至重度智力障碍、语言运动发育迟缓等行为和社交问题[4]，在遗传检测中，全突变样本还经常检出前突变，甚至正常大小条带，这类个体称为嵌合体，在FXS男性中占12%～41%[5]。嵌合男性因具有非甲基化正常或前突变等位基因，能表达部分FMRP蛋白[5]，对FXS面部畸形、智力迟钝等临床表型有所减轻，由于嵌合体CGG重复序列模式的异质性，使得个体临床表型差异显著，FXS临床诊断非常困难，尤其是产前诊断和遗传咨询面临诸多困境。

　　本组例1全突变男性胎儿，各组织的CGG重复数目和甲基化情况均一致，都是完全甲基化的540个CGG重复。例2FXS前突变/全突变嵌合体，CGG重复序列在各组织中数目相同，但具有明显的组织差异，未甲基化前突变比例在外周血中较高，脑中很低，与之相应脑组织中的FMRP表达甚微，表明嵌合体中前突变比例在不同组织中差异很大。国外报道2例FXS前突变与全突变嵌合型男性胎儿，分别为妊娠15周胎儿(包括肺、骨髓、视神经叶及肾脏)和20周胎儿(包括脑、睾丸、肝脏、胰脏、肺脏、脾脏、肾脏及胸腺)，2例胎儿不同组织间CGG重复数目十分相近，15周胎儿视神经前突变较其他组织高，骨髓甚微，20周胎儿各组织前突变比例均无差别，2例各组织中FMRP表达情况未进行分析[6]。嵌合男性因具备正常或前突变等位基因，可表达部分FMRP蛋白，由于其嵌合比例偏低和(或)组织间嵌合差异，多数情况下不足以恢复正常认知功能[7]，也有报道1例高功能FXS男性，由于其大部分脑区有大范围的前突变和FMRP表达，该患者无智力障碍，仅表现学习困难、轻度注意力不集中等[8]。

　　目前为止CGG重复序列不稳定发生的具体机制仍不明确，通过特殊病例研究推测出CGG重复扩增发生在卵母细胞第1次减数分裂前期和受精后6～7d内[9，10]，有研究在1对全突变CGG重复数目不同的女性同卵双胞胎的研究中，根据其母亲CGG重复数目(CGG29/84)和双绒毛膜双羊膜型同卵双胞胎类型，推测受精前卵母细胞CGG重复由前突变扩增至全突变，受精后3d内再次发生扩增[11]。本研究2例胎儿CGG重复数目均大于其母亲CGG重复数目，在卵母细胞第1次减数分裂前期或受精后胚胎发育早期发生扩增，由于例2为前突变/全突变嵌合体，且嵌合比例具有组织异质性，因此推测在三胚层分化前，例2胚胎部分细胞团还发生了一次从全突变缩减至前突变事件，前突变细胞团随机迁移到不同胚层，该过程中前突变细胞迁移到不同胚层的数目差异较大，因此导致前突变比例组织异质性。

　　本研究表明部分FXS男性患者外周血中的CGG重复状况不能取代其他组织中的情况，因此临床常规外周血CGG重复数目和甲基化情况检测不能准确反映其他组织中实际情况，必要时可采集与脑同胚层来源的发根、口腔上皮等无创样本行进一步分析参考。本研究在男性嵌合体临床诊断和表型评估中可发挥一定指导作用，并在产前诊断和遗传咨询中对胎儿表型预测提供依据，也为CGG不稳定机制研究提供了有价值的信息。