杆状病毒表达载体系统及其应用

 

杆状病毒的基因表达分为立早期表达、早期表达、晚期表达、极晚期表达4个阶段。其中在极晚期基因表达过程中有两种高效表达的蛋白：多角体蛋白和P10蛋白，两个基因的启动子均具有很强的启动性。多角体蛋白基因polh是一个表达量极高的极晚期基因，感染后期在细胞中的累积可高达30%～50%，从基因组中删除polh基因时，其子代病毒不能形成多角体，但并不影响病毒体的复制，因此，polh基因位点是杆状病毒表达系统的理想外源基因插入位点[2]。P10也是一个高效表达的极晚期基因，同时又是病毒复制非必需基因，因此P10位点也常被用作外源基因插入位点。

 

 

杆状病毒表达系统具有以下的优越性[11,12,13]：(1)安全性高：杆状病毒的宿主仅限于无脊椎动物，而对人畜和其他脊椎动物没有感染性，特异性强，相对于腺病毒载体(Adenovirusvector)和慢病毒载体(Lentivector)来说，安全性好。(2)表达效率高：应用杆状病毒极晚期多角体蛋白启动子和P10蛋白启动子强效表达外源蛋白，表达量最高可达所感染细胞总蛋白量的50%，而且多角体蛋白和P10蛋白是病毒基因组内的非必需片段，插入外源基因后不影响病毒的复制和感染。(3)表达的蛋白具有生物学活性：相对于原核表达系统来说，昆虫细胞为真核生物细胞，其对蛋白质表达后修饰加工的方式与哺乳动物细胞接近，能识别并正确地进行信号肽的切除及磷酸化、糖基化等反应，并且使外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成，使其在结构及功能上接近天然蛋白。(4)外源基因在插入到多角体蛋白基因座位时，必然引起后者的缺失或灭活，因此，重组病毒将不能产生多角体，这不仅为重组病毒提供了供选标记，而且重组病毒不能像野生病毒一样在环境中存在，更加安全。(5)容量大：杆状病毒基因组大约130Kb，具有多个天然强启动子，也易于构建新的人工启动子，可同时表达多个基因，并且可容纳大片段外源基因。(6)基于BmNPV所构建的重组病毒具有更狭窄的宿主范围，除了家蚕外，基本没有其他宿主，而且家蚕没有飞行能力，完全靠人类饲养，而且关于家蚕的研究已持续多年，遗传背景相对清楚，大规模饲养技术成熟，成本大大降低。正是由于该表达系统具有的优点，目前已有病毒、细菌、真菌、动植物等多种生物的基因在昆虫细胞或幼虫体内获得高表达。

 

 

杆状病毒由于基因组相对较大,外源基因的克隆不能通过酶切连接的方式直接插入，必须通过转移载体的介导。构建转移载体时，将拟插入杆状病毒位点的基因(如多角体基因和P10基因)编码区的侧翼序列分别克隆进入同一质粒载体中，然后将外源基因及相应的启动子克隆在两段侧翼序列之间。转移载体构建成功后，将载体与野生型杆状病毒共转染昆虫细胞，通过两侧同源边界区在细胞内发生同源重组，外源基因及启动子替代杆状病毒相应的区域而产生重组病毒。如果插入的是多角体基因的位置，那么重组病毒将不会产生多角体，可以以此将重组病毒和野生病毒区分开来，然后通过多轮的空斑实验纯化重组病毒。但由于野生型病毒的重组效率极低，只有0.1%～1%，而且表型差别不显著，重组病毒筛选困难，在应用上有一定的困难。通过近年来学者们的不断探索,在转移载体插入一些筛选基因，如β-半乳糖苷酶、TK基因[14]、Neo基因[15]，或者对野生型杆状病毒加以改造，如Cre-Loxp定点转座[16,17]、线性化、Bacmid等，不仅在杆状病毒的重组效率上有了很大的提高，而且重组杆状病毒的筛选与鉴定也越来越方便，容易。

 

在质粒构建中，蓝白斑筛选是重组子筛选的一种重要方法。含有完整LacZ阅读框的细菌，在诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的作用下，在生色底物X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。

 

1990年，Vialard等[18]在多角体基因的上游，利用P10基因启动子带动LacZ基因，用多角体蛋白启动子驱动外源蛋白，构建了转移载体pJVNheI。将其与野生型AcMNPV共转染Sf9细胞后，重组病毒没有多角体的产生，并且可以表达β-半乳糖苷酶,通过加入X-Gal使之形成蓝色空斑，可以很方便的进行重组病毒的筛选。虽然这种方法便于重组病毒筛选，但是病毒的重组效率还是很低，仅有0.1%-1%左右的重组率。

 

Kitts等[19]根据线性DNA比一般环状DNA更易发生重组的特征，在杆状病毒多角体蛋白基因座位导入了一个单一的内切位点(Bsu36I)，在与供体质粒共转染之前，将杆状病毒DNA用Bsu36I酶切后，共价闭合环状的dsDNA线性化，转染细胞后，大约30%的后代病毒为重组病毒。

 

1993年，Kitts和Possee又改进了这个系统，使之与肉眼选择和复制选择相结合[20]。在杆状病毒的多角体座位上加入LacZ基因，并在多角体蛋白基因两侧(ORF1629和ORF603基因内)各引入一个Bsu36I位点，这个被修饰过的AcMNPV称为BacPAK6突变株。Bsu36I酶切后，不仅使杆状病毒DNA线性化，而且也除去了上述两个基因组片段，破坏了开放阅读框ORF1629。因为ORF1629对杆状病毒复制是必需的，所以失去这两个片段后，只有与转移载体质粒DNA重组后，恢复ORF1629，才能产生有活性的病毒，同时，重组病毒不具有LacZ，在X-Gal和IPTG存在时将呈现出白色，更加有助于重组病毒的筛选。此方法产生重组病毒的频率高达85%-99%。

 

 

1993年，Luckow等研究人员成功开发了一种快速、高效产生重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的技术，其利用细菌Tn7转座子原理，在大肠杆菌内完成重组病毒的构建，取名为Bac-to-Bac表达系统[21,22,23]，意为从细菌(bacterium)到杆状病毒(baculovirus)，革命性地改变了重组昆虫杆状病毒的构建方法(图1.1)。

 

该系统利用细菌mini-F复制子和Tn7转座子，构建了一种杆状病毒穿梭载体Bacmid，含有细菌单拷贝数mini-F复制子、卡那霉素(Kanamycin,Kan+)抗性选择标记基因及编码β-半乳糖苷酶α肽的部分DNA片段，并且导入了细菌attTn7转座子靶位点。该杆状病毒穿梭载体可像质粒一样在大肠杆菌中生长，又对鳞翅目昆虫细胞具有感染性。将其(130kb)转化入大肠杆菌(E.coil)DH10，获得转化子将其命名为DH10Bac。在DH10中还有一个辅助质粒(helperplasmid，13.2kb)，该质粒编码Tn7转座酶，并且含有四环素(Tetracycline,Tet+)抗性基因。而供体质粒pFastBac上mini-Tn7转座子左右臂之间有一个完整的表达框，包括庆大霉素(Gentamincin,Gen+)抗性基因、杆状病毒PPH启动子(或PP10启动子)、多克隆位点及SV40polyA等元件。外源基因插入到杆状病毒启动子下游的多克隆位点，将此重组的供体质粒转化DH10Bac感受态细胞，在编码的转座酶作用下，由mini-Tn7转座子将供体质粒上的表达框插入到Bacmid的靶位点，破坏lacZα基因的表达。在含有Kan+、Gen+、Tet+、IPTG和X-Gal的培养板进行筛选，重组的Bacmid(即重组病毒基因组)转化体菌落将呈白色，而非重组Bacmid转化菌落依然为蓝色。因此可以通过菌落的颜色进行重组病毒的筛选。通过挑选单个白色菌落进行培养，抽提得到重组Bacmid基因组，随后转染入昆虫培养细胞获得重组病毒，即可进行重组蛋白的表达生产。

 

基于BmNPV的Bac-to-Bac系统在2005年由Motohashi等人成功建立[24]，吴小锋和曹翠萍等人并对BmNPV病毒基因组进行了改造[25,26]，在多角体位点插入了含有细菌单拷贝mini-F复制子、编码β-半乳糖苷酶α肽的部分DNA片段(即lacZα基因)和卡那霉素抗性基因的片段，完成了家蚕BmBacmid。然后将Bacmid转化入大肠杆菌DH10α，得到的转化子命名为BmDH10Bac。

 

目前，已经有多种基因在重组杆状病毒中进行了表达[2,3,27,28,29,30,]，包括有病毒基因，细菌基因，植物基因，无脊椎动物和脊椎动物基因，以及人类的基因等。这些基因的表达为研究它们的功能、应用、对疾病的预防和治疗等方面发挥了很大的作用。

 

研究发现，杆状病毒虽然是昆虫专性病毒，但它能进入哺乳动物细胞而不能复制。在哺乳动物病毒启动子(如CMV立即早期启动子)的控制下，外源基因能在哺乳动物细胞多种细胞中表达，且对细胞无毒性[31,32,33,34]。

 

在2003年，Lindsay等就提出了用杆状病毒作为基因治疗载体来治疗人类前列腺癌症的设想[35]。在2006年LiuXiaoyun[36]等采用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒Ac-CMV-Sox9，(Sox9是公认的能够延缓和逆转椎间盘退变的治疗基因)，证明Sox9基因(Ac-CMV-Sox9)能在离体培养的兔髓核细胞中有效表达，并能够促进退变的兔髓核组织细胞中Ⅱ型胶原含量增加而延缓和逆转椎间盘退变。

 

由于杆状病毒的启动子在哺乳动物细胞内是沉默的，因而它不能在哺乳动物细胞中复制和表达；同时杆状病毒的DNA游离于细胞内且不与宿主细胞内的基因物质以及机体中的潜在缺陷病毒进行整合，因而没有发生插入突变的风险；杆状病毒也不引起机体的免疫排斥反应；由此可见，BEVS可以作为一个极具开发和应用前景的基因治疗载体。

 

杆状病毒作为基因工程疫苗研究的载体，既可以用来表达亚单位疫苗抗原，也可以直接用作DNA疫苗注射到体内，产生免疫效果。

 

WangSP[37]等构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinerespiratoryandreproductivesyndromevirus，PRRSV)修饰的ORF5和ORF6双基因共表达的重组假型杆状病毒疫苗，小鼠免疫试验证实，重组病毒所诱导的IFN-γ水平和中和抗体水平均明显高于常规DNA疫苗免疫组。余光清[38]等也用该系统构建了表达日本血吸虫的谷胱甘肽S-转移酶(GST)的重组DNA疫苗，也获得了较好的免疫保护力。

 

XiaolinZhang[39]等在2009年用Bac-to-Bac系统构建了重组BmNPV在蚕蛹里表达了幽门螺杆菌幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)热休克蛋白A亚单位(HspA)和尿素酶B亚单位(UreB)，对小鼠免疫试验发现，发现经口服蚕蛹表达的幽门螺杆菌HspA和UreB能使小鼠产生特异性免疫应答，对抗幽门螺杆菌感染有免疫保护和免疫治疗作用。

 

除此之外，重组杆状病毒表达伪狂犬病毒糖蛋白[40]、流感病毒血凝素[41,42]、兔病毒性出血症病毒VP60蛋白[43]等的DNA疫苗也获得了较好的免疫效果，表明重组杆状病毒DNA疫苗是一种具有良好发展前景的疫苗载体。

 

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