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病毒学研究的细胞培养

2018-07-31 来源:中国病毒学论坛  标签: 掌上医生 喝茶减肥 一天瘦一斤 安全减肥 cps联盟 美容护肤
摘要:病毒会感染几乎每一种生物机体,但这些病毒无法独立生活,它们需要进入宿主细胞内部。因此,病毒学家希望了解和研究这些病毒就需要培养细胞。

 病毒会感染几乎每一种生物机体,但这些病毒无法独立生活,它们需要进入宿主细胞内部。因此,病毒学家希望了解和研究这些病毒就需要培养细胞。临床病毒学家可能需要将病人的样品加入到细胞中,寻找感染的证据;研究人员也需要利用细胞作为生物学实验容器来分析细菌,另外利用病毒感染细胞,或者表达特定的病毒蛋白,发现病毒的行为特征和宿主应答的方式。

 
通过了解几位病毒学家的培养思路和技巧,介绍了一些病毒-细胞培养系统和方法。
 
选择细胞
 
选择哪种细胞取决于病毒。最明显的首选就是作为病毒天然宿主的动物或者组织中的细胞,比如骆驼细胞就是中东呼吸综合征寻找宿主细胞的第一选择。但宿主细胞并不一定就可以。美国国立卫生研究院国家过敏症和传染病研究院的副主任MarshallBloom在开始研究阿留申水貂病病毒的时候,他曾试过水貂细胞,以及每一种他能买到的哺乳动物细胞系,但唯一能发生感染的是猫肾细胞。
 
Bloom教授和来自佛罗里达大学的名誉教授RichardCondit建议说,如果一种病毒被证明十分挑剔,那么就要多准备一些细胞系,如HeLa细胞系,这种细胞系可作为多种病毒的宿主。此外幼仓鼠肾(BHK)细胞和来自鸡胚胎的成纤维细胞也可以试试。
 
除了细胞类型,病毒学家还必须做出另一个选择,那就是选择直接从生物机体中培养的原代细胞,还是选择经过多年培养且传代多次的永生细胞系。两者都有利有弊。永生细胞系,如HeLa的优点就是方便,易于生长,可重复性高。来自洛克菲勒大学丙肝研究中心的研究员MohsanSaeed指出,大多数病毒研究采用的就是这种细胞系。但是这种细胞大多只能将其相似之处传递给生物机体中的另一细胞,它们不断分裂,改变了它们的新陈代谢,而且也经常发生去分化,重新回归到了原始状态。最关键的是,对于病毒学家来说,这些细胞系只是表现出异常的免疫应答活动,而不是像体内细胞那样对病毒产生防御力,因此从这些细胞系中得到的结果可能就是不确定的,或者错误的。因此Saeed认为,如果可能的话还是用原代细胞。原代细胞看起来更像体内细胞,反应也更像体内细胞,但是这些细胞会出现并发症,它们需要特殊的培养技巧,而且最终还是会死亡。
 
如果一个实验室希望用的是人体原代细胞,那么这又要增加一层难度了。一般来说这些细胞内容可以通过商业化产品获得。然而,有时研究人员需要的组织类型并没有哪家公司有卖,或者希望选择特殊的细胞来源,那么他们就不得不去医院寻找细胞了。与克隆系的均一细胞不同,捐赠组织会随着个体差异而发生变化,这也是有利有弊的。一些研究人员希望了解病毒如何感染个体病患的,但是一般分子病毒学家还是希望重现性较好,但使用不同批次原代培养细胞,会增加重现性难度。
 
病毒
 
细胞当然只是培养体系的一半,另一半病毒也存在选择上的问题。一旦病毒开始在培养基中生长,那么它们就会发生改变,为了适应生长速度或毒力而产生突变。Bloom在研究中就发现猫肾培养基中的阿留申病毒会导致水貂患上一种轻微的疾病,至今他们也不清楚其中的原因。
 
病毒来源的选择主要看个人的研究目的,如果你希望感染培养基中的每一个单细胞,分析细胞的反应,那么可以选择高感染性的实验室毒株,但是如果要分析潜在治疗的效果,那么建议选择野生型病毒。
 
在选好细胞系和病毒毒株后,研究人员就要开始考虑所用病毒的剂量,以及感染的持续时间。定量病毒感染培养基所需份量,以及计算空斑或蚀斑数量最经典的方法就是在培养皿或培养瓶中的单层细胞实验,每个蚀斑都是单个病毒粒子感染的应答。研究人员可以利用手头上的数据获得他们想要的感染复数(multiplicityofinfection,MOI),即感染实验中病毒-细胞的比率。如果MOI为1,就是每个细胞对应一个病毒,那么只需要感染三分之二的细胞。因为病毒是随机扩散,一些细胞没有碰到病毒感染,而旁边的细胞却有两到三个粒子感染。
 
此外,研究人员还需监控感染过程,最明显的变化就是致细胞病变效应(CPE),大多数的培养细胞能以平铺单层细胞生长,但被感染的细胞也许会出现聚合,或者破裂。“细胞看上去状态并不好,但仍然存活着,并且繁殖病毒”,FieldsVirology操作指南作者Condit说。不过并不是所有的感染都会导致CPE的出现,因此研究人员可能需要采用其它方法,对于培养皿或孔,研究人员可以采用PCR来识别病毒基因,或者Westernblotting来检测病毒蛋白。但找到病毒核酸或蛋白并不一定就确认了病毒的感染和复制能力,比如说,许多HIV研究者会检测核心病毒蛋白p24是否存在,如果一不小心,他们也许识别的就是原初接种的不完整非活性病毒粒子中的p24。
 
Kaushic教授提示说,对病毒的复制力需要多方面评估。比如他们实验室就会增加一个HIV指示细胞系,这些细胞来自HeLa细胞系,能表达HIV受体,以及受HIV序列调控的β-半乳糖苷酶基因,如果这些细胞接触到活着的HIV,就会在X-Gal中呈现出蓝色来。
 
此外,还有一些工具能帮助研究人员识别被感染的单个细胞,这包括活细胞病毒基因原位荧光杂交,以及固定细胞蛋白免疫荧光等。一些实验室会将荧光蛋白基因插入到病毒基因组中,这样培养基中感染细胞就会发光,但是这些额外插入的基因也许会减慢病毒生命周期,Saeed说。而且增加的核酸也会改变RNA的二级结构,影响翻译的速度,从而造成细胞无法高效的完成病毒粒子基因组复制。
 
另一个选择可以考虑改变细胞,这样就能在出现变化的时候进行指示。洛克菲勒实验室曾构建了一个人肝癌细胞:Huh7.5,这种细胞被丙肝病毒感染,病毒蛋白酶能裂解一种成为MAVS的细胞内蛋白,后者一般锚定在线粒体外膜上。研究人员设计了一个嵌合基因,将MAVS裂解位点,线粒体靶向序列,与红/绿荧光蛋白连接到一个核定位序列上。在未感染细胞中,生成的蛋白栓在线粒体上,当病毒进入细胞,蛋白酶就会切断受体蛋白,核定位序列就会带着这些序列进入细胞核,这样研究人员就能很方便的识别出感染细胞与未感染细胞。在未受感染的细胞,由此产生的蛋白质仍然拴线粒体。当病毒进入细胞时,蛋白酶劈开记者蛋白,和核定位序列接管。

组织工程
 
有些时候可能细胞与病毒的简单选择并不能满足模型感染的需要,“对于某些病毒来说,培养过程的生态环境也很重要”,Ramanan说。例如,肝炎病毒不会只感染体内肝细胞肝脏中还有血管内皮细胞、免疫细胞和其他细胞类型,即使这些细胞都不被感染,但是还是会影响病毒的感染过程。
 
来自麻省理工学院实验室的研究人员研发了一种微模式肝细胞培养系统,这一系统采用模具将胶原点打入每个培养孔的底部,然后培养人原代肝细胞,这些细胞会选择性的粘附到胶原上,周围是小鼠胚胎成纤维细胞。活细胞在培养基中能维持其极性,并存活数周,这比一般细胞培养的几天时间要长,可用于研究乙肝病毒和丙肝病毒的生命周期。
 
另一种方式,就是让培养基更接近于三维基质细胞生长环境中的组织细胞。例如,研究人员可以在一个胶基质中组合不同的细胞类型,构建一个三维“类器官”。但是对于病毒学家来说,这种方法存在一个缺点,由于所使用的基质,病毒也许无法遍及整个区域,而且也很难判断病毒粒子是否能接触到类器官内部的细胞,不如单层细胞那么好控制。
 
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