复旦大学袁正宏研究员HCV研究最新突破性进展

 

HCV主要由血液/体液传播，据世界卫生组织估计，全球有1.7亿人感染HCV。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，致使约50%~80%HCV感染者发展为慢性肝炎，其中20%~30%将发展成肝硬化，肝硬化患者中每年有1%~4%发展成为肝细胞癌症。HCV基因组排列顺序为5'-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3'，能编码一长度大约为3014个氨基酸的多聚蛋白前体，后者可经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成10种病毒蛋白，包括三种结构蛋白，Core、E1和E2蛋白。p7是一种离子通道，对其是否为结构蛋白还存在争议。非结构蛋白部分则包括NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B，它们对病毒的生活周期非常重要，其中NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B组成复制酶，完成HCV基因组复制。

 

自1989年发现HCV以来，体外培养系统的缺失成为HCV研究瓶颈问题。直到2005年日本科学家Wakita从一位病人体内分离出JFH1病毒株才成功构建了世界首个HCV全基因感染性分子克隆，为HCV研究打开了一个全新局面。今年的拉斯克临床医学奖授予了三位HCV研究人员：德国海德堡大学的RalfBartenschlager；美国洛克菲勒大学的CharlesRice以及加拿大生物制药公司ArbutusBiopharma的MichaelSofia。其中Bartenschlager和Rice是因为他们对解析HCV如何在肝脏细胞中进行复制的机制做出了贡献。而Sofia则是由于将这些基础研究发现实现临床转化，研发出获得FDA批准的药物：Sofosbuvir，这种药物已成功治愈了被丙肝病毒感染的80多万患者。尽管现在已有高效治疗药物，但是丙型肝炎发病机理仍未十分清楚，其中之一就是膜结构复制复合体的组装机制。

 

为了回答这一问题，袁正宏研究员与化学系陆豪杰教授展开合作，对病毒复制酶进行亲和纯化，鉴定出与病毒复制酶结合的宿主分子，以期阐明膜结构复制复合体的组装分子机制。研究人员在不影响病毒复制的前提下，对病毒NS5A和NS5B分别接上HA和His标签，通过两步亲和纯化，经质谱鉴定出与复制酶相互作用的宿主蛋白。通过siRNA实验验证，研究人员找到了Sec16A,Shroom3,ANKFY1,UPF1和VCP这5个新分子，能够影响病毒的复制，其中VCP作用最为显著。后续机制研究发现VCP的ATP酶活性是病毒复制所必须的，VCP在感染的细胞中与NS5A共定位。当VCP的ATP酶活性缺失时，导致NS5A在胞内的定位异常，而影响复制酶复合体的组装。

 

这一研究结果说明了HCV在感染过程中通过劫持宿主的AAAATP酶VCP来调控复制酶复合体的组装，扩展了人们对HCV的复制的深入理解。文章第一作者是易志刚副研究员和方彩云副教授。研究得到了复旦大学基金和国家重大基础研究等项目的资助。

 

原文摘要：

 

AffinitypurificationoftheHepatitisCvirusreplicaseidentifiesValosin-containingprotein(VCP)AAA+ATPaseasanactiveviralreplicationmodulatorZhigangYi1#,CaiyunFang2,JingyiZou1,JunXu1,WuhuiSong,XiaotingDu1,TingtingPan1,HaojieLu2andZhenghongYuanABSTRACTLikealmostallthepositive-strandRNAviruses,HepatitisCvirus(HCV)induceshostintracellularmembranemodificationtoformthemembrane-boundviralreplicationcomplex(RC),withinwhichviralreplicaseamplifytheviralRNAgenome.DespiteaccumulatedinformationaboutHCVco-optshostfactorsforviralreplication,ourknowledgeofthemolecularmechanismsofhowviralproteins,hijackhostfactorsforreplicaseassemblyhasonlybeguntoemerge.PurificationoftheviralreplicaseandidentificationofthereplicaseassociatedhostfactorstodissecttheirrolesinRCbiogenesiswillshedlightonthemolecularmechanismsofRCassembly.Soughttopurifytheviralreplicaseinthecontextofgenuineviralreplication,wedevelopedaHCVsubgenomicrepliconsysteminwhichtwodifferentaffinitytagsweresimultaneouslyin-frameinsertedintotheHCVNS5AandNS5B.Aftersolubilizingtherepliconcells,wepurifiedtheviralreplicasebytwo-step-affinitypurificationandidentifiedtheassociatedhostfactorsbymassspectrometry(MS).WeidentifiedValosin-containingprotein(VCP)AAA+ATPaseasanactiveviralreplicationmodulatoranditsATPaseActivityisrequiredforviralreplication.TransientreplicationassayindicatedVCPismainlyinvolvedinviralgenomeamplification.VCPassociatedwithviralreplicaseandco-localizedwithviralRCmarker.Further,InaHCVreplicaseformationsurrogatesystem,abolishingVCPfunctionresultedinaberrantdistributionofHCVNS5A.WeproposeHCVmayco-optahostAAA+ATPaseforitsreplicaseassembly.ImportanceAlmostallthepositive-strandRNAvirusesshareacommonreplicationstrategy,inwhichviralproteinsmodifyhostmembranestofromthemembrane-associatedviralreplicase.Viruseshijackhostfactorstofacilitatethisenergyunfavorableprocess.Understandingthisfundamentalprocessishamperedbythechallengestopurifythereplicaseduetothetechnicaldifficulties.Inthisstudy,wedevelopedaHCVsubgenomicrepliconsysteminwhichtwodifferentaffinitytagsweresimultaneouslyin-frameinsertedintotworeplicasecomponents.Usingthisdual-affinity-taggedrepliconsystem,wepurifiedtheviralreplicaseandidentifiedValosin-containingprotein(VCP)AAA+ATPaseasapivotalviralreplicaseassociatedhostfactorthatisrequiredforviralgenomereplication.AbolishingVCPfunctionresultedinaberrantviralproteindistribution.WeproposeHCVhijackahostAAA+ATPaseforitsreplicaseassembly.UnderstandingthemolecularmechanismofVCPregulatesviralreplicaseassemblymayleadtonovelanti-viralstrategiestargetingthemostconservedviralreplicationstep.