中科院上海巴斯德所张驰宇组建立适于病毒检测的新荧光PCR方法

 

传染病严重威胁人类健康，超过70%的新发突发传染病由病毒造成。与其他病原体相比，病毒最大的特点在于其高变异性，这成为病毒检测的最大挑战。高变异会严重干扰检测结果的准确性、影响检测的灵敏度、增加引物和探针的设计难度。因此较难获得高变异病毒的高广谱和高灵敏的检测方法。现有的PCR、qPCR及各种恒温扩增方法（如LAMP，RPA等）均不能很好解决病毒高变异性对检测的影响。

 

为了解决高变异对病毒检测影响的问题，上海大学联合培养硕士研究生张梦玲，在导师张驰宇研究员的指导下，建立了一种基于高保真酶的新荧光PCR方法。该方法使用HFman探针，依赖高保真聚合酶的3’-5’外切酶活性，可以高效切除探针3’荧光标记的碱基，启动扩增。无论探针（或引物）3端是否存在与模板的错配，聚合酶均可以高效地启动扩增，不受错配影响，因此可以容忍突变模板。与传统TaqMan探针法相比，该方法只需要一个HFman探针和一条对应引物，设计相对简单。为了验证方法的可靠性，我们建立了HIV-1病毒载量测定的方法。为了检测方法的灵敏性和可靠性，我们选择了21个HIV阳性的临床样品（覆盖高、中和低病毒载量），同时用新方法和罗氏的最新款HIV-1病毒载量试剂盒（COBAS?AmpliPrep/COBAS?TaqMan?HIV-1Test,v2.0）进行了比较，结果显示新方法与罗氏的试剂盒检测结果具有很好的一致性，表明了新方法和HIV-1定量检测方法具有良好的商业化开发前景。

 

除了用于病毒检测外，稍加改进，该方法也可以用于突变（SNP）的检测,目前该方法已申请了2项专利。

 

该研究得到了上海市疾病预防控制中心钟平教授、林悦博士，以及上海巴斯德研究所金侠教授的大力帮助和支持。项目获得了国家传染病重大专项和国家自然科学基金等项目的资助。

 

Abstract

 

Thebiggestchallengeforaccuratediagnosisofviralinfectiousdiseaseisthehighgeneticvariabilityofinvolvedviruses,whichaffectsamplificationefficiencyandresultsinlowsensitivityandnarrowspectrum.Here,wedevelopedanewsimpleqPCRmediatedbyhigh-fidelity(HF)DNApolymerase.ThenewmethodutilizesanHFmanprobeandoneprimer.Fluorescentsignalwasgeneratedfromthe3′–5′hydrolysisofHFmanprobebyHFDNApolymerasebeforeelongationinitiation.Mismatchesbetweenprobe/primerandtemplatehavelessinfluenceontheamplificationefficiencyofthenewmethod.ThenewqPCRexhibitedhighersensitivityandbetteradaptabilitytosequencevariabletemplatesthantheconventionalTaqManprobebased-qPCRinquantificationofHIV-1viralload.FurthercomparisonwithCOBASTaqManHIV-1Test(v2.0)showedagoodcorrelationcoefficient(R2?=?0.79)betweenbothmethodsinquantificationofHIV-1viralloadamong21clinicalsamples.Thecharacteristicsoftolerancetovariabletemplatesandoneprobe-oneprimersystemimplythattheprobe/primerdesignforthenewmethodwillbeeasierandmoreflexiblethantheconventionalmethodforhighlyheterogeneousviruses.Therefore,theHFDNApolymerase-mediatedqPCRmethodisasimple,sensitiveandpromisingapproachforthedevelopmentofdiagnosticsforviralinfectiousdiseases.