清华大学王新泉和向烨团队揭示冠状病毒入侵细胞关键步骤

 

蛋白质或蛋白质复合物的三维结构为其可以生物学功能提供重要依据。获得用于构成活体细胞的各种各样大分子(macro-molecules)生物组件的高分辨率图像信息结构生物学(structuralbiology)研究的主要目之一。

 

常用的研究技术包括：X线晶体成像技术(x-raycrystallography)以及核磁共振质谱分析检测技术(nuclearmagneticresonancespectroscopy,NMRspectroscopy)。不过这两种技术都有各自的局限性，比如X线晶体照相术只能够对生长得极为有序的三维结晶进行观察，而核磁共振光谱分析检测技术则要求被检测样品的纯度非常高，不能够有重叠峰出现。有很多生物大分子相互结合、组装之后形成的都是非常大的，或者非常不稳定、比较罕见的结构，都不太适合用上述这两种技术进行分析和检测。

 

单粒子电子显微镜技术(Single-particleelectronmicroscopy,EM)则能够观察少量非结晶样品，获得高分辨率的结构图谱；“低温冷冻电镜技术(cryo-electronmicroscopy,cryo-EM)可获得高质量的、低信噪比(signal-to-noiseratio,SNR)的三维结构图像。二者相结合而成的单粒子低温电子显微镜（cryo-EM）是继高分辨率方法X-射线晶体学及核磁共振（NMR）质谱法之后的又一种结构测定技术。

 

2015年12月30日，单粒子低温电子显微镜（cryo-EM）技术被《NatureMethods》盘点为2015年度最受关注的技术成果。

 

冠状病毒为有包膜的单股正链RNA病毒，可以感染多种哺乳动物和鸟类物种。目前，已确定能感染人类的冠状病毒有六种。其中，α类的HCoV-229E和HCoV-NL63和β类A系的HCoV-OC43和HCoV-HKU1通常引起轻度和自限性上呼吸道感染。2002年，β类B系的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）造成全球超过8000人感染及近800人死亡；2012年，另一个高致病性谱系β类C系中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）于沙特阿拉伯出现，目前已造成全球超过1800人感染与640例相关死亡。虽然研究者对SARS-CoV和MERS-CoV在流行病学，病毒学，临床等方面进行了广泛的研究，但是目前尚无批准的抗病毒药物和疫苗治疗和预防其感染。

 

冠状病毒包膜上的S蛋白参与病毒与宿主细胞接触、受体结合以及病毒-宿主细胞膜融合，同时也是中和抗体结合及疫苗研发的重要靶点。SARS-CoV的S蛋白由含有1300aa的前体蛋白合成，可以被宿主弗林蛋白酶样蛋白酶切割成氨基（N）末端S1亚基和羧基（C）末端S2亚基。其中，S1亚基含有受体结合域（RBD）结构域，可以与细胞表面的受体特异性结合，是决定细胞嗜性、宿主范围和动物传播的关键部分。S2亚基含有疏水性融合环和两个七重复区域（HR1和HR2），具有卷曲螺旋结构。以往的研究表明，单体S可以组装形成三聚体并锚定在病毒包膜上。RBD与细胞受体会触发S1和S2亚基构象变化进而导致融合的暴露环和插入靶细胞膜。S糖蛋白三聚体中的HR1和HR2区域随后可形成六螺旋束融合核心，连接病毒和宿主细胞膜密切并列促进融合。

 

对于高致病性SARS-CoV和MERS-CoV，S1亚基中的RBD和S2亚基中的融合后核心已经在结构和功能上进行了单独的研究。SARS-CoV的单粒子冷冻电子显微镜（cryo-EM）研究曾报道S糖蛋白三聚体16.0?的分辨率下的结构。最近也报道了在4.0?,4.0?和3.4?分辨率下小鼠肝炎病毒（MHV）和人冠状病毒HKU1和HCoV-NL63S糖蛋白三聚体融合前结构。但是，仍缺乏对高致病性SARS-CoV的结构和MERS-CoVS糖蛋白三聚体高分辨率的结构分析。并且，为了更好的理解受体结合的分子机制，也需要了解冠状病毒S糖蛋白三聚体膜融合过程的中间构象变化过程。

 

本研究通过冷冻电镜单颗粒三维重构的方法解析了SARS-CoVS蛋白的四种构象结构。其中构象一为三重对称的结构，分辨率达4.3?，该构象下S蛋白的三个受体结合区（RBD）均处于“向下”位置，由于空间位阻，SARS-CoV的细胞受体血管紧张素转化酶2（ACE2）无法结合刺突蛋白，因此该构象为受体结合的失活状态。其余三种构象的分辨率分别为在7.3?，5.7?和6.8?，均为非对称性，受体结合区域RBD通过不同角度旋转从“向下”位置变为“向上”位置，该构象下ACE2能顺利结合RBD而没有空间位阻，因此这三种构象为受体结合的活化状态，并且，这种RBD从“向下”位置到“向上”位置的转换也是中和性抗体与spike的结合所必需。该现象可推广至将S1亚基的CTD1作为受体结合区的其他β类冠状病毒，对理解冠状病毒侵染宿主细胞的分子机制，以及特异性药物和疫苗的开发提供了重要指导。

 

结论

 

本研究利用cryo-EM单分子结构测定了SARS-CoVS糖蛋白三聚体存在的四种不同构象。结构分析显示这些构象一个C末端的位置上不同域1（CTD1），其作为的RBDS糖蛋白三聚体。进一步结构比较表明，CTD1结构域“向下”到“向上”的位置变化实现了S糖蛋白三聚体从受体结合“失活”到“活化”状态，这也是SARS-CoV与细胞受体ACE2结合以及被单克隆抗体中和的先决条件。

 

Abstract

 

TheglobaloutbreakofSARSin2002-2003wascausedbytheinfectionofanewhumancoronavirusSARS-CoV.TheinfectionofSARS-CoVismediatedmainlythroughtheviralsurfaceglycoproteins,whichconsistofS1andS2subunitsandformtrimerspikesontheenvelopeofthevirions.HerewereporttheectodomainstructuresoftheSARS-CoVsurfacespiketrimerindifferentconformationalstatesdeterminedbysingle-particlecryo-electronmicroscopy.Theconformation1determinedat4.3?resolutionisthree-foldsymmetricandhasallthethreereceptor-bindingC-terminaldomain1(CTD1s)oftheS1subunitsin“down”positions.Thebindingofthe“down”CTD1stotheSARS-CoVreceptorACE2isnotpossibleduetostericclashes,suggestingthattheconformation1representsareceptor-bindinginactivestate.Conformations2-4determinedat7.3,5.7and6.8?resolutionsareallasymmetric,inwhichoneRBDrotatesawayfromthe“down”positionbydifferentanglestoan“up”position.The“up”CTD1exposesthereceptor-bindingsiteforACE2engagement,suggestingthattheconformations2-4representareceptor-bindingactivestate.ThisconformationalchangeisalsorequiredforthebindingofSARS-CoVneutralizingantibodiestargetingtheCTD1.ThisphenomenoncouldbeextendedtootherbetacoronavirusesutilizingCTD1oftheS1subunitforreceptorbinding,whichprovidesnewinsightsintotheintermediatestatesofcoronaviruspre-fusionspiketrimerduringinfection.