乙肝防治须重视乙肝表面抗原突变隐患 慢性乙型肝炎抗病毒疗效预测的几种新指标

　　乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒（HBV）感染后首先出现的血清学标志物，也是临床上应用最多的HBV感染血清标志物。由于HBV病毒的复制特点以及乙肝疫苗、抗病毒治疗的广泛应用，HBsAg突变在慢性HBV感染患者中非常常见。突变会导致患者HBsAg检测结果呈阴性，但其血清或肝脏中仍存在HBVDNA，即隐匿性HBV感染（OBI）。

　　在近期举行的“HBsAg突变全球多中心研究解读媒体会”上，台湾大学医学院教授高嘉宏指出：“OBI患者如果作为献血者或肝移植供体，将会对输血和手术安全构成重大隐患。同时，HBsAg突变会加速隐匿性乙型肝炎向肝硬化或肝癌进展，并引发免疫抑制后的HBV再激活，导致检测试剂漏检、疫苗保护失败、抗病毒治疗失败等，对疾病进展和疗效判断造成重要影响。”

　　会上，国家卫计委临床检验中心教授王露楠分享了一项针对中国献血者隐匿性乙肝S基因相关突变的血清学特征研究。998份HBsAg-/HBVDNA+样本中，有70.3%的HBVDNA定量结果小于20IU/mL，仅有2.4%的样本HBVDNA定量值大于200IU/mL；这些样本中最常见的血清学模式是抗HBc/抗HBe同时阳性，和单独抗HBc阳性；OBI样本中最常见的基因型为B和C；有92.24%的OBI样本发生了突变，高于HBsAg阳性菌株发生突变的情况。

　　王露楠表示：“OBI的发生与S基因突变有关，且OBI患者的突变率更高，这对实验室检测能力提出了新的挑战。血清学检测试剂的设计不仅要满足灵敏度和特异性，还要具备HBsAg突变检测的能力。传统的酶联免疫吸附试验的突变检测能力有待提高。目前结果显示电化学发光法具有优异的HBsAg突变检出能力。”

　　“HBsAg突变全球多中心研究”首次采用真实临床患者样本，排除以往使用实验室制备的“重组”HBsAg蛋白可能存在的潜在偏倚，1553例HBV感染患者样本有407例来自中国。研究发现：超过70%的样本发生了HBsAg突变，全球范围内不同流行地区及不同基因型中总体突变率无显着差异。其中，大部分中国患者样本为基因型C，而多位点突变频率在基因型C感染的人群中更高。在超过30%的中国患者样本中发现了47种位于“a”决定簇区域的特有突变，这是对于诊断及临床都非常重要的区域，可能与宿主免疫反应差有关，可导致假阴性诊断结果。

　　研究还对四种HBsAg商业试剂（罗氏诊断ElecsysRHBsAgII免疫检测、两种基于磁珠颗粒的HBsAg免疫检测、HBsAgELISA检测）进行了性能比较分析。结果发现，ElecsysRHBsAgII的灵敏度最高，达到99.94%；成功识别出研究中所有（含突变体）的真实临床患者样本，证实了HBsAg突变对该试剂的检测性能没有影响。ElecsysRHBsAgII定性和定量检测试剂均采用独特的抗原抗体反应体系设计，并使用3种单克隆抗体和1种多克隆抗体的组合，能够检测到目前所有已知的HBV血清型，对于HBV感染的筛查、诊断和监测具有重要价值。

　　慢性乙型肝炎抗病毒疗效预测的几种新指标

　　CHB患者疗效预测和监测的传统指标主要有ALT复常、HBVDNA阴转、HBeAg血清学转换等。近年来，新的指标不断出现，受到临床医生重视的主要指标有血清HBsAg和HBeAg定量、抗-HBc定量、cccDNA定量、HBV核心相关抗原（HBcrAg）定量、超灵敏HBVDNA和HBVRNA等。进一步提高了CHB患者抗病毒疗效预测和监测效果，值得扩大样本量进一步验证其价值。

　　01.血清HBsAg定量

　　CHB患者血清HBsAg水平与肝内cccDNA关系密切，其可以反映肝组织内cccDNA水平。血清HBsAg的下降与肝内HBVDNA或cccDNA的下降速度平行，可以在一定程度上反映肝脏组织中cccDNA的清除。研究显示，免疫清除期的CHB患者血清HBsAg水平与肝组织中cccDNA有较好的相关性，但在免疫耐受期患者与低病毒复制期患者中两者的相关性较差。大量研究已经证实，CHB患者血清HBsAg水平在判断慢性HBV感染的自然史、预测聚乙二醇干扰素（PEG-IFN）和NAs抗病毒疗效以及确定停药时机方面具有重要价值。对于接受PEG-IFN治疗的患者，用药12周时HBsAg不下降则预示IFN抗病毒治疗应答不佳，应停止治疗。另外有研究发现，CHB患者停药时HBsAg水平是预测停药后复发的强独立预测因子。Chen等回顾性分析使用拉米夫定治疗52～243(89.3±35.9)周并停药后随访1年以上的初治CHB患者，Cox回归分析显示停药时HBsAg水平较高、年龄大和男性是治疗结束后乙型肝炎复发的独立预测因子，而停药时患者血清HBsAg水平是CHB患者停药复发的最强预测因子，停药时患者血清HBsAg水平＜300IU/ml时，HBeAg阳性患者中有55.6%实现HBsAg清除，而HBeAg阴性患者HBsAg＜120IU/ml时，可以预测有79.2%的HBsAg清除。另一项关于恩替卡韦初治患者停药后的研究也得出类似结论，HBeAg血清转换后HBsAg＜250IU/ml且年龄＜50岁的患者复发率只有5%，并且52.4%的患者可以在停用恩替卡韦后维持HBsAg＜200IU/ml。Hosaka等研究显示，开始NAs治疗6个月时HBsAg快速下降的CHB患者，不论HBeAg阳性或阴性都有着较高的HBsAg消失率。国内Cai等研究显示，HBsAg水平＜2log10IU/ml的患者在停止替比夫定治疗后有93%的可能维持治疗后的持续HBeAg血清学转换。

　　在IFN治疗方面，国内张楠等研究显示，IFN治疗6个月时患者血清HBsAg下降＞0.5log10IU/ml的CHB患者ALT复常率、HBeAg阴转率和HBeAg血清学转换率均高于下降＜0.5log10IU/ml的患者，差异具有统计学意义。Piratvisuth等研究显示，HBeAg阳性CHB患者接受PEG-IFNα-2a单药或联合拉米夫定治疗48周，治疗24周时HBsAg＜1500IU/ml的患者完成48周疗程后，停药随访24周时的HBeAg血清学转换率为54.4%，而治疗24周时HBsAg＞20000IU/ml的患者，停药随访24周时的HBeAg血清转换率仅有15.4％。在NAs经治患者序贯IFN治疗方面，国内Ning等在恩替卡韦治疗后序贯PEG-IFN治疗的研究中同样发现，开始序贯IFN治疗时HBsAg水平＜1500IU/ml是预测HBsAg消失和HBeAg血清学转换的最佳截断值，基线HBeAg消失且HBsAg＜1500IU/ml的患者可实现33.3%的HBeAg血清学转换及22.2%的HBsAg消失率，而开始序贯治疗12周时HBsAg＜200IU/ml能获得77.8%的HBsAg消失率和66.7%的HBeAg血清学转换率。

　　02.血清抗-HBc定量

　　HBcAg是HBV的结构蛋白，存在于病毒Dane颗粒的核心，具有高度的免疫原性，感染HBV的患者几乎均会产生抗-HBc。随着双抗原夹心法检测试剂的应用，慢性HBV感染者血清中总的抗-HBc水平已经可以定量检测。Song等通过对HBV感染康复者、隐匿性HBV感染者和CHB患者的检测发现，慢性HBV感染者的抗-HBc水平显著高于HBV感染康复患者和隐匿性感染者，说明HBV抗原是刺激和维持抗-HBc水平的重要因素，HBV感染康复者因为体内已经无抗原存在，因此抗体水平较低，而慢性HBV感染者因为病毒抗原的持续存在使得免疫应答持续存在，致抗-HBc的水平随之持续升高，另外，该研究还发现，ALT升高的慢性HBV感染者血清抗-HBc水平显著高于ALT正常的慢性HBV感染者，提示抗-HBc水平能反映机体的抗病毒免疫状态。抗-HBc水平除可以反映HBV感染在体内自然史和肝脏炎症活动度以外，最新研究进一步证实，基线抗-HBc水平有助于预测HBeAg阳性患者NAs及IFN疗效，是CHB患者接受抗病毒治疗后是否发生HBeAg血清学转换的最佳预测因子，从而达到对患者进行优化抗病毒治疗的目的。王贵强教授等开展了一项多中心双盲HBeAg阳性患者接受PEG-IFN治疗48周并随访24周的随机对照研究，发现多个基线指标预测72周治疗应答的多变量logistic回归分析显示，唯有基线抗-HBc水平与HBeAg血清学转换、病毒学应答及联合应答独立相关。同时发现基线抗-HBc水平≥30000IU/ml者HBVDNA及HBeAg水平抑制更显著。采用基线抗-HBc定量联合ALT预测疗效，结果发现无论ALT是否＞5倍正常值上限，基线抗-HBc水平越高，血清学及病毒学应答率越高。Hou等研究同样发现，基线抗-HBc水平对IFN和NAs的疗效有预测价值，超过一些传统指标，使用IFN治疗的HBeAg阳性患者，如果基线抗-HBc水平＞4.4log10IU/ml且HBVDNA水平＜9log10拷贝/ml，那么有65.8%的患者可以实现HBeAg血清学转换。对于使用替比夫定、恩替卡韦治疗的HBeAg阳性CHB患者，基线抗-HBc水平高，HBVDNA水平低，有37%的患者实现HBeAg血清学转换。血清抗-HBc定量有望成为CHB患者接受抗病毒治疗后判断停药时机及停药后是否易于复发的疗效预测指标。

　　03.cccDNA定量

　　cccDNA的形成是HBV复制周期中的最关键环节。只要肝细胞中仍存在cccDNA，在病毒抑制状态被解除后就有可能再次复制活跃，因此，被认为是CHB患者停用抗病毒治疗药物后复发的最主要原因。只有完全清除肝细胞内cccDNA才会使患者停药后复发的几率降到最低，因此，在停药前明确患者体内的cccDNA水平对减少停药后复发具有重要意义。另外，大量研究表明，肝细胞内的cccDNA水平与血清cccDNA及HBsAg水平具有显著相关性，这与目前研究显示HBsAg水平越低的患者停药后复发概率越低相一致。近年来，随着以选择性实时荧光PCR技术为代表的cccDNA定量检测技术的发展，cccDNA检测已经逐渐具备开展条件。监测肝细胞内HBVcccDNA能更好的反映机体免疫状态对病毒的真实控制情况，为抗病毒治疗终点的选择提供客观和准确的依据，但目前主要受限于检测需要通过肝组织检查提供样本，患者接受度不高。

　　04.HBcrAg定量

　　研究显示通过化学发光酶免疫分析技术检测HBcrAg能有效间接反映肝内cccDNA水平变化，对CHB患者抗病毒治疗后病毒反弹及耐药情况监测有重要价值。Matsumoto等发现，HBcrAg＜3.0log10U/ml的CHB患者停用NAs1年后HBcrAg水平逐渐升高，HBV复制水平也逐渐增高。Chuaypen等研究显示，在接受PEG-IFN48周治疗的患者中，治疗12周时HBcrAg下降迅速的患者在24周时出现HBeAg清除的比例高于下降缓慢的患者，以8.0log10U/ml为截断值，24周HBeAg清除的阴性预测值可以达到100%。国内Ma等的研究结果也显示，与治疗前相比，在48周治疗结束时HBcrAg下降＞0.565log10kU/ml，随访24周结束时HBeAg血清学转换的阴性预测值为100%。HBcrAg水平可以间接反映肝组织内cccDNA水平，有助于减少肝穿刺的风险和创伤，因此，HBcrAg可以作为一项针对CHB患者接受抗病毒治疗后动态观察病情变化实用而有效的监测手段。

　　05.HBVRNA定量

　　研究发现，在慢性HBV感染者的血清中可以检测到HBVRNA，而且血清HBVRNA和肝组织中的cccDNA水平密切相关，可以用来判断NAs和IFN的疗效。在NAs治疗期间，HBVRNA的下降是HBeAg血清学转换的独立预测因子。Hatakeyama等对接受恩替卡韦和拉米夫定治疗的患者分析发现：在1年内发生YMDD变异的患者血清HBVRNA水平的中位数显著高于治疗1年后发生或从未发生过YMDD变异的患者。表明在拉米夫定治疗过程中，HBVRNA水平是一个有价值的预测病毒变异的因子。vanBommel等收集了62例慢性HBV感染者，其中HBeAg阳性50例，接受抗病毒治疗的平均时间为30个月。研究结果显示，相比于HBVDNA、HBsAg、ALT、HBV基因型、年龄和性别，治疗3个月和6个月后的HBVRNA下降水平最能预测HBeAg血清学转换。验证了在使用聚合酶抑制剂治疗的乙型肝炎患者中，早期的HBVRNA下降与随后的HBeAg血清学转换相关，即血清HBVRNA的动态变化可预测治疗效果。

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