丙型肝炎直接抗病毒药物的耐药相关问题探讨

　　直接抗病毒药物（Direct-actingantiviralagents，DAAs）治疗慢性丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）感染可获得很高的持续病毒学应答（Sustainedvirologicresponse，SVR）率。但仍有一些患者不能获得有效应答或会在停药后复发，成为难治患者。这种情况除了与患者肝纤维化严重、基线病毒载量高有关外，与基线或治疗中HCV存在耐药相关变异（Resistanceassociatedvariants，RAVs）有关。

　　《国际肝病》邀请主任邢卉春教授解读DAAs的RAVs问题，分别从RAVs的定义、不同作用靶点DAAs的RAVs，以及RAVs带来的临床问题三个方面进行阐述。

　　一、DAAs耐药相关变异的概述

　　目前临床用于抗HCV的DAAs作用关键靶点分别是NS3/4、NS5A及NS5B，分别编码蛋白酶（NS2、NS3和NS4区）、RNA依赖的RNA聚合酶（NS5B）和NS5A蛋白［1］，由于HCV是高复制的RNA病毒（每日产生和清除1010-13病毒颗粒），且在复制过程中保真性较低（平均每次复制就会产生约RNA10-5～10-4的错配率/碱基），使得在HCV感染期间，患者体内同时存在多种高度多样化的HCV变异群体（即准种）［1］。

　　与DAAs相关的NS3、NS5A及NS5B在不同的基因型、基因亚型间或在同一基因型、基因亚型内不同病毒株间存在异质性，其中能够引起DAAs疗效降低的氨基酸多态性称为RAVs。这种RAVs可以在初次用DAAs前就存在（称为预存耐药相关变异）或者是经过抗病毒治疗，在药物压力的选择下而出现。出现RAVs可能会使患者对DAAs的抗病毒治疗失败。因此需高度关注DAAs的RAVs。

　　二、不同作用靶点DAAs耐药相关变异

　　不同HCV基因型或亚型和应用不同作用靶点DAAs而产生的RAVs各不相同。

　　1、NS3/4A蛋白酶抑制剂耐药相关变异

　　NS3/4A丝氨酸蛋白酶（Proteasesinhibitor，PI）为非共价结合的二聚体，包括催化亚基NS3及其活化亚基NS4A。NS3/4A蛋白酶的底物结合沟槽较浅，靶向于NS3/4A的DAAs与之结合较疏松，常常需要与酶上的多个辅助结合位点相互作用才能保证紧密结合。这些辅助结合位点的变异均会使病毒产生耐药性，因此，NS3/4A蛋白酶抑制剂耐药屏障较低。

　　已报道的NS3/4A蛋白酶抑制剂的RAVs有Q80K、V36A/M、T54A/S、R155K/T、A156S/T、D168N（氨基酸位点）。体外研究显示，存在Q80K可使Simeprevir（SMV）的抗病毒作用降低10倍[3,1]。预存Q80K可使SMV联合聚乙二醇化干扰素＋利巴韦林的SVR率降低26%［2，4］，也能显著降低SMV联合Sofosbuvir（SOF）的疗效[5,1]。所幸中国HCV基因1a型患者流行率很低，相关Q80K的发生率较低。

　　2、NS5A抑制剂耐药相关变异

　　NS5A是一种高度磷酸化的非结构蛋白，参与HCVRNA的复制、HCV组装及病毒颗粒的释放过程[6]。NS5A抑制剂是目前DAAs中抗病毒效果最强的一类，但已上市NS5A抑制剂最大的缺点就是易出现耐药相关变异，且RAVs适应性很强，与野生株相比有很大的竞争力，可以长期存在[7]，属于中、低耐药屏障。

　　就我国最为常见的HCV基因1b型来说，临床相关RAVs主要发生于NS5A区，基线预存耐药率为11%～23%［1，8］，但在DAAs治疗失败者中可以高达50%［9］。HCV1a亚型NS5A的RAVs主要发生在氨基酸N末端M28T、Q30H/R、L31M和Y93H/N位点变异以及基因1b亚型的L31M和Y93H，均与NS5A抑制剂的耐药有关，且NS5ARAVs病毒株可以在治疗失败的患者体内存在长达２年之久[10]，对后续治疗可能产生一定影响。

　　3、NS5B聚合酶抑制剂耐药相关变异

　　NS5B是RNA依赖的RNA聚合酶，该靶点的DAAs主要有核苷类聚合酶抑制剂（Nucleotideinhibitory,NI，如SOF）和非核苷类聚合酶抑制剂[Non-nucleosideinhibitory，NNI，如dasabuvir（DSV）]。

　　NNI通过与酶表面的变构位点结合，改变酶的空间构象，抑制NS5B聚合酶的催化活性，从而抑制病毒的复制。NNI的RAVs主要涉及氨基酸位点C316、M414、Y448和S556。体外研究显示，DSV对C316N变异株的抗病毒活性降低5倍[12]，但对其他聚合酶抑制剂耐药变异（包括S282T及M423T、P495A、P495S及V499A）的病毒株仍有很好的抗病毒活性[12]。

　　NI是作为聚合酶的底物，与细胞内的三磷酸核苷竞争性地插入到新产生的核苷酸链中，终止链的延伸而抑制病毒复制。该酶的活性中心非常保守，不易变异，因此，NI具有较高的耐药屏障[14]，目前尚未发现自然存在的针对SOF的RAVs[15]。体外复制系统中的研究发现针对SOF耐药的变异包括S282T、L159F及E341D；S282T在所有基因型中均可有，但主要在G1a及G1b基因型［1］，但临床病例中很少能检测到[16]。虽然有报道提示L159F、C316N与V321A可能与治疗失败有关［17］，但总体发生率很低[18]。

　　三、DAAs耐药相关变异带来的临床问题

　　1、RAVs对DAAs抗HCV的疗效的影响

　　存在RAV可能对临床应用DAAs治疗HCV感染带来不利影响。ASPIRE研究显示基因1a型、且预存Q80K变异与未预存该变异相比，使用SMV（100mg）的持续病毒应答（SVR）率分别为22%及70%[19］。提示Q80K的存在会影响到SMV的抗HCV疗效，预存Q80K变异者不推荐用含有SMV的方案。

　　预存与未预存L31M和Y93H变异者，在Daclatasvir（NS5A抑制剂）/Asunaprevir（PI）联合治疗HCV感染时，SVR率分别为43%及87%[20]。预存L31M和Y93H变异还可使Grazoprevir/Elbasvir、SOF/Ledapasvir或SOF/Velpatasvir的SVR分别下降5倍［21］及9%[22]。虽然在含有蛋白酶抑制剂和NS5B聚合酶抑制剂的方案治疗失败后可发现S282T存在，但其发生率很低、适应性低，对临床抗病毒治疗中SVR的影响很有限。

　　2、针对耐药相关变异的临床对策

　　由于不同种类的DAAs耐药的RAVs谱不同，DAAs联合治疗可以增加耐药屏障，降低RAVs的发生，因此目前临床上用的DAAs方案均是两个或两个以上不同靶点药物的联合方案。

　　另外研究中显示，联合利巴韦林（ribavirin，RBV）可以克服NS5ARAVs所带来的负面效应，如在一项应用Ledipasvir/SOF24周治疗基因1型代偿期肝硬化患者的Ⅱ、Ⅲ期临床研究中，联合RBV使SVR12由85%提高到100%［23］；在另一项Daclatasvir/SOF治疗肝硬化或晚期纤维化的患者中，联合RBV也可显著提高存在NS5ARAVs患者的SVR率［24］。

　　我们更期待新研发的DAAs能有更强的抗病毒活性及更高的耐药基因屏障。

　　3、RAVs检测

　　现有的抗HCV的DAAs方案，总体来说有效率很高（多数在90%），虽然基线预存耐药变异或治疗期间产生的耐药变异可能对某些抗病毒治疗方案的SVR会有些影响，但发生率不高，且由于当前耐药检测方法及评价标准尚未统一规范，因此多数指南并没有推荐在抗病毒治疗前先进行耐药变异的普遍筛查。但是对于基线时预存L31M、Y93H或Q80K会影响SVR率的DAA方案，在拟选用前应该了解患者预存RAVs情况。

　　HCV的耐药相关变异的检测在不同实验室其检测的敏感性不一样[15]。目前检测方法主要包括[25，20，26]：①表型耐药研究：即测定抑制病毒复制所需的药物浓度如EC50或EC90；②DNA测序：包括PCR产物直接测序、克隆测序及新一代深度测序等方法。前者灵敏度低、克隆测序费时费力，而深度测序的截断值尚未标准化，开展HCV耐药变异检测仍有待标准化规范的制订[27]。