多肽合成中的茚三酮检测（The Kaiser Test）

　　1.试剂配制

　　试剂1：5g茚三酮溶解到100ml乙醇中

　　试剂2：80g苯酚溶解到20ml乙醇中

　　试剂3：2ml0.001MKCN加入到98ml重蒸吡啶中

　　关于试剂的配制有几点注意事项：

　　茚三酮和苯酚不是太好溶，尤其是苯酚，溶解时应注意。氰化钾在显色反应中起到催化作用，如有剧毒试剂氰化钾不好搞到的话可以不加。重蒸吡啶时最好在吡啶中加入一定量的茚三酮，在重蒸过程中可以除去吡啶中使茚三酮变色的物质。

　　配置好的茚三酮溶液应避光保存。

　　2.检测操作

　　取少量树脂于小玻璃管或小子弹头中，用DCM或者乙醇多次洗涤树脂，过滤除去洗涤液，加入上述每种试剂2-5滴，混匀。100℃下加热5分钟。观察显色结果。

　　关于检测操作的注意事项：

　　树脂不要取太多，KT检测很灵敏，取太多的话会影响检测结果。用DCM洗涤的话洗涤液一定要滤干净，否则加热过程中树脂会喷出。加热时间应该控制好，时间过短可能会造成假阳性（游离氨基还未反应显色）。加热时间过长氨基酸的Fmoc保护基和赖氨酸的Boc侧链保护基会掉，出现假阴性结果。

　　3.显色结果

　　KT检测是针对游离氨基的一种灵敏的检测方法，当有游离氨基存在时，检测结果为蓝色。如在固相合成中脱除Fmoc保护基后检测树脂，会观察到不透明的深蓝色。特殊的氨基酸残基会显示出别的颜色，如脯氨酸，其仲氨基显红色。Asp,Asn,Cys,Ser,和Thr会显示出红棕色（比脯氨酸颜色深，容易观察）。当没有游离氨基存在时，检测结果显黄色或无色，如固相合成是氨基酸偶联完全，没有游离氨基，次时检测显示出黄色或无色。所以可以用这种方法定性判断偶联反应终点。

　　脯氨酸

　　4.四氯苯醌检测

　　试剂配制

　　对于特殊的脯氨酸，可以使用四氯苯醌检测，试剂配制方法如下

　　试剂1：2ml乙醛加入到98mlDMF中

　　试剂2：2g四氯苯醌加入到98mlDMF中

　　操作步骤

　　取少量树脂用DCM或者乙醇洗涤，滴入上述试剂各两滴，混合均匀，室温静置5min，若存在游离氨基，树脂显蓝色。