抗体药物电荷异质性研究进展：碱性组分中分离出影响Fc功能的非岩藻糖化蛋白

　　抗体药物电荷异质性研究进展：碱性组分中分离出影响Fc功能的非岩藻糖化蛋白

　　作为大分子蛋白，由于其表达体系的不确定性导致其结构的多变性，抗体药物的质量控制一直是研究的难点和热点。从一级结构的氨基酸序列，到二级结构的二硫键连接，再到高级结构的蛋白质构像，任何维度的结构变化都可能对药物的稳定性和活性产生影响，因此近十几年来抗体药物的结构与功能关系研究始终处于研究的前沿。

　　基于这些结构与功能研究工作的深入，进一步给抗体药物的质量控制提供了指导。在“质量源于设计”的指导框架下，平台化的工艺开发过程中，基于蛋白质本身的物理化学特性，抗体药物的多聚体含量、电荷异质性、疏水异质性和糖基化分布检测一直是抗体药物的初步质量控制手段。

　　抗体药物电荷异质性结构与功能关系共识

　　这些抗体蛋白的物理化学通常会互为影响，一方面的影响会引起另一方面的变化。例如，糖基化中唾液酸化蛋白比例的增加通常会引起电荷异质性中酸性蛋白比例的增加。作为共识，早前时候对于碱性蛋白的研究通常与氨基化、去赖氨酸化和甲硫氨酸氧化的蛋白杂质联系在一起。

　　但是前不久，维也纳自然资源与生命科学大学（University of Natural Resources and LifeSciences, Vienna）、新加坡A_STAR生物研究中心和Apeiron Biologics在一株嵌合性抗GD2抗体（ch14.18）的结构研究中，发现碱性化蛋白与非岩藻糖化和高甘露化蛋白的含量呈正相关性，进一步影响ADCC等相关的Fc片段效应功能，这也应该是抗体碱性变体与糖基化异质性有关的首次报道，为下游工艺中糖基化异质性的去除和抗体药物的质量控制提供了指导（Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors. mAbs,2016, VOL. 8, NO. 8, 1548-1560）。

　　碱性电荷异质性蛋白的发现

　　在对不同临床时期的抗GD2抗体（ch14.18）进行结构比对研究时，研究者发现三个不同时期生产批次的药物的电荷异质性有明显差异。“Newton”批次生产于2004年；“Darwin”批次生产于2011年，下游纯化工艺小幅改进后的试运行批；“Curie”批次生产于2013年，转移到新的外包服务商的GMP运行批。IEF和IEX的分析结果均表明，最早的生产批次“Newton”主峰含量明显低于后面生产的两个批次（“Darwin”和“Curie”），而酸性峰和碱性峰含量则明显高于后两批。

　　三个批次的IEF分析结果

　　三个批次的制型IEX分析结果

　　随后研究者通过制备型色谱对各个批次下的蛋白进行区段收集，对最早期的“Newton”批次的碱性峰收集了多达25区段，进一步做了结构与功能的分析。

　　碱性电荷异质性蛋白的分析

　　随后研究者使用SPR分别对这些分离的区段与GD2、FcγRⅢa和 FcRn结合力进行了分析，以反映这些区段蛋白的活性、ADCC活性和半衰期。

　　GD2 binding的SPR分析结果

　　GD2 binding的SPR分析结果表明，相对主峰蛋白，随着蛋白的酸性和碱性程度越高，GD2 binding的Kd越大，意味着与GD2的结合能力越弱。从几个批次来看，“Newton”批次与GD2的结合能力最低，“Darwin”批次的优之，“Curie”批次的最高，其活性也最高。

　　FcγRⅢa binding的SPR分析结果

　　ADCC活性检测分析结果

　　CDC活性检测分析结果

　　糖基化分布检测分析结果

　　FcγRⅢa binding的SPR分析结果表明，相对酸性蛋白，主峰和碱性蛋白FcγRⅢa结合能力更强，意味着其ADCC能力更高。特别值得注意的是，“Newton”批次中的B2含量显著低于其它批次。因此从几个批次来看，“Newton”批次与FcγRⅢa的结合能力最高，即ADCC活性最高；“Darwin”批次的次之；“Curie”批次的最低。

　　碱性区段中到底是哪些特定蛋白影响了药物的ADCC呢？研究者很自然地想到了进一步对这些分离区段进行糖基化分布的分析，结果表明，在碱性组分中的高甘露糖化和非盐藻糖化蛋白比例明显高于酸性峰和主峰，这显然与大家对高甘露糖化和非盐藻糖化蛋白的功能认识相符的。

　　为了进一步验证碱性组分中是否还有其它的蛋白变体，研究者发现碱性组分1(B1)和碱性组分2(B2)中的甲硫氨酸氧化、N端焦谷氨酸化和C端去赖氨酸化程度基本一致，排除了由其它途径带来的结构变化，说明这些碱性蛋白主要是由高甘露糖化和非盐藻糖化的蛋白引起的。

　　FcRn binding的SPR分析结果

　　FcRn binding的SPR分析结果表明，主峰、碱性组分1(B1)和碱性组分2(B2)与FcRn 的结合能力是最强的，更高程度的酸性蛋白和碱性蛋白都会减少与FcRn 的结合能力。

　　CH2和CH3的Nano DSC分析结果

　　通过Nano DSC进一步对分离组分进行热稳定性分析，发现各批次不同组分的CH2和CH3转化温度基本一致，说明组分之间的热稳定性没有差异。但是“Newton”批次各组分的CH2和CH3均高于其他批次，说明该批次下的药物稳定性与其他两个有明显差异，这可能是由于“Newton”不同的制剂配方引起的。

　　碱性电荷异质性蛋白的产生原因

　　按照“质量源于设计”的思路，通常在发现质量差异后，继而鉴定结构与功能的关系，再进一步回到工艺中分析质量差异的产生原因，以利于后期质量的稳定控制。但本研究中研究者并没有回到工艺中寻找质量差异的源头。可能是整个项目开发时间太长，蛋白结构的变化很难确定是否是由于工艺变化引起还是储存稳定性引起的。研究者推测这些批次的电荷异质性有可能是由于制剂配方和存储温度的差异引起的，也有可能是基于“Darwin”和“Curie”改良的下游工艺引起的。

　　小编小结

　　从这一研究的研究思路看，很难说明是一项特别完整的研究，甚至部分数据令人十分费解。但是研究者们仍然用相对完整的研究，首次从碱性电荷异质性蛋白中分离出高甘露糖化和非盐藻糖化的蛋白，为其它药物的结构研究和质量控制提供了借鉴。

　　同时，本文也是首次利用WCX-10分析柱在制备规模分离这些电荷区段，为后期在下游阶段设计分离工艺提供了借鉴。不同电荷组分的抗体蛋白等电点差异极小，基本在0.1~0.2 pH单位，传统的纯化工艺很难将它们去除，创新型填料的开发有可能实现这一目标。另一方面，抗体的糖基化基本为中性糖，目前下游基本没有相关方法去除相关杂质，很大程度由上游细胞株和培养工艺决定，优化途径极为有限。如果本文研究结果具备普遍性，是否意味下游特定工艺也可以分离相关糖基化变体，这对工艺开发研究人员和结构研究者是个好消息。

　　最后，需要说明的是，对于抗体药物的电荷异质性研究仍然需要具体问题具体分析。不同药物的电荷变化原因也不尽相同，同时这些电荷结构的变化是否会引起药物功能的变化也是疑问。值得注意的是，去年FDA批准的两个抗体类似药CTP-13和ABP501，都与原研药的电荷分布有较大差异，进一步说明抗体药物的电荷异质性控制是个难点，相关研究也应依具体项目而有所差异。