基因工程改良T细胞 用于癌症免疫疗法

人体免疫系统的功能是区分本体和外来物，从而保护机体的健康。但肿瘤对免疫系统来说是一个独特的挑战——它来源于自身的细胞，让免疫系统难以识别；此外，肿瘤构建的微环境对免疫反应的抑制也让T细胞难以发挥杀伤功能。

近年来，通过基因工程改良T细胞作为“活的药物”来消灭癌细胞是癌症疗法的一个新方向。使用表达嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptors，CAR)和转基因T细胞受体(TCellReceptors，TCRs)的T细胞在治疗血癌的临床试验中表现惊人。这些结果也让诸多业内资深人士继续保持热情，并催生了《Nature》杂志对这一领域的盘点和展望。

T细胞被完全激活需要两种不同信号：一种信号是通过T细胞表达的TCR与由主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)呈现的抗原相结合产生。这种信号(信号1)给T细胞的反应带来特异性。同时T细胞还需要另外一种刺激信号（信号2），这一类刺激信号是激活或关闭T细胞功能的开关。激活T细胞功能的配体包括4-1BB配体、ICOS配体、CD70等等。而著名的关闭T细胞功能的配体包括PD-L1，很多肿瘤细胞会增加细胞表面PD-L1的表达量，从而抑制T细胞的免疫反应。

通过转基因方法在T细胞中表达的TCR与T细胞本身表达的TCR在结构上没有明显的区别。主要的区别是用转基因方法在T细胞中表达的TCR已经过人工筛选，可以与肿瘤抗原相结合。但是这些T细胞仍然需要同时被信号2刺激才能被完全激活，因而仍然会受到PD-L1一类抑制免疫反应的蛋白的抑制。而且，肿瘤抗原仍然需要被MHC呈现才能够被TCR识别。很多肿瘤会通过降低MHC表达量来逃避TCR的识别。而CAR将识别肿瘤抗原的抗体片段与TCR的胞内域（IntracellularDomain）片段和接受第二种刺激信号的受体胞内域片段嵌合在一起。这种受体不需要MHC的辅助就可以识别肿瘤抗原，同时也不需要信号2就可以激活T细胞。

CAR自从出现以来，它的结构经过了多次改进。第一代的CAR蛋白的胞内域只有一个媒介TCR信号的CD3ζ片段。而第二代的CAR的胞内域添加了媒介信号2的CD28或者4-1BB片段。而第三和第四代CAR则在胞内域部分整合了三种或四种刺激信号的受体片段，从而使激活T细胞的效率变得更高。

T细胞疗法的生产流程包括以下9个步骤：

(1)将白细胞从患者的血液中分离出来。

(2)通过逆流离心淘洗(CounterflowCentrifugalElutriation)或其它方法富集淋巴细胞。

(3)富集的淋巴细胞在体外培养环境中接受特定抗原刺激。

(4)同时，通过病毒载体导入编码CAR或TCR的基因片段。

(5)这些淋巴细胞在生物反应器中分裂增殖。

(6)当淋巴细胞达到足够数量后会经过清洗去除没有表达预订CAR或TCR的T细胞。

(7)浓缩后的细胞样本会接受质量检查。

(8)然后冰冻成为最终产品运送到诊所。

(9)诊所的医生将产品解冻，注回患者体内。

随着CAR-T细胞技术的发展，更多的设计理念和模型被推出和尝试。这些新设计赋予CAR-T细胞更丰富的功能，并对它的杀伤力做出更精确的控制。它们包括：

(a)让CAR-T细胞同时也表达抗肿瘤的细胞因子（例如IL12)，通过识别肿瘤的CAR，这些T细胞能够在肿瘤细胞附近表达促进炎症的细胞因子，从而吸引更多体内免疫细胞聚集到肿瘤病灶，增强抗癌反应。

(b)现在的CAR-T细胞需要从患者体内获取淋巴细胞进行改造，因为这些细胞在注回患者体内时不会被患者的免疫系统排斥。如果在CAR-T细胞中敲除内源性TCR和MHC分子，可以防止这些T细胞引发宿主的免疫排斥反应，从而使这些CAR-T细胞在不同患者身上都可以使用，成为通用的CAR-T细胞。

(c)如果在CAR-T细胞中加入趋向因子受体，这些受体可以通过与肿瘤分泌的趋向因子相结合，增强CAR-T细胞的靶向功能。

(d)很多肿瘤的微环境中存在大量的免疫检查点受体的配体，它们与CAR-T细胞表面的免疫检查点受体结合会抑制T细胞的激活。通过基因工程消除免疫检查点蛋白的表达或者使用阻断免疫检查点信号通路的单克隆抗体可以让CAR-T细胞对免疫抑制产生抗性。

(e)CAR-T细胞的一个弊端是如果CAR除了识别肿瘤细胞中的抗原，还与健康细胞中的抗原发生反应，将导致CAR-T细胞误杀健康组织，情况严重可能导致患者死亡。在CAR-T细胞中引入自毁机制，可以使这些细胞在接触特定配体后会发生细胞凋亡，从而减少CAR-T细胞误伤的风险。

(f)减少CAR-T细胞误伤健康组织的另一个方法是使CAR-T细胞的激活受到某种小分子的控制，只有在这种小分子存在时T细胞才会被激活。

(g)另一种消除CAR-T细胞毒副作用的方式是在CAR-T细胞表面表达一种被现有单克隆抗体识别的肿瘤抗原，如果CAR-T细胞的毒副作用过大，给患者使用单克隆抗体可以消灭这些CAR-T细胞。

(h)增强CAR-T细胞对肿瘤的专一性也可以防止CAR-T细胞的毒副作用。在这方面的设想包括在CAR的胞外域加入识别两种不同蛋白的抗体片段，只有靶向细胞同时表达这两种蛋白时CAR-T细胞才会被激活。

(i)这种需要识别两种不同抗原才能激活CAR-T细胞的调控方式也可以通过在CAR-T细胞表面表达两种不同的CARs来实现。每一种CAR只能激活一条信息通路，只有两条信息通路同时被激活时CAR-T细胞才会被激活。

(j)另一种保护正常组织不受CAR-T细胞损害的方法是在CAR-T细胞上表达一种能够抑制细胞激活的CAR.这种CAR的抗体片段能够识别正常细胞表达的抗原，而它的细胞内部分能够抑制T细胞激活（比如PD1受体的细胞内片段）。这种CAR-T细胞只会在肿瘤抗原存在而正常细胞表达的抗原不存在的情况下才会被激活。